Was sind Spannungsklemmen?

Was sind Spannungsklemmen?

Die Spannungsklemme

Das Voltage Clamp Defined Wiki

Die Spannungsklemme wird von Elektrophysiologen verwendet, um die Ionenströme über eine neuronale Membran zu messen, während die Membranspannung auf einem festgelegten Niveau gehalten wird. Neuronale Membranen enthalten viele verschiedene Arten von Ionenkanälen, von denen einige spannungsgesteuert sind. Die Spannungsklemme ermöglicht die Manipulation der Membranspannung unabhängig von den Ionenströmen, wodurch die Strom-Spannungs-Beziehungen von Membrankanälen untersucht werden können.[1]

Das Konzept der Spannungsklemme geht auf Kenneth Cole[2] und George Marmount[3] aus den 1940er Jahren zurück. Cole entdeckte, dass es möglich war, zwei Elektroden und einen Rückkopplungskreis zu verwenden, um das Membranpotential der Zelle auf einem vom Experimentator festgelegten Niveau zu halten.

Alan Hodgkin erkannte, dass es zum Verständnis des Ionenflusses durch die Membran notwendig war, Unterschiede im Membranpotential zu eliminieren.[4] Nach Experimenten mit der Spannungsklemme skizzierten Hodgkin und Andrew Huxley 1952 die ionischen Ursachen des Aktionspotentials, wofür sie 1963 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin erhielten.[

Technik

Die Spannungsklemme ist ein Stromgenerator mit zwei Elektroden. Die transmembranäre Spannung wird über eine „Spannungselektrode“ relativ zur Erde aufgezeichnet, und eine „Stromelektrode“ leitet Strom in die Zelle. Der Experimentator stellt eine „Haltespannung“ oder ein „Befehlspotential“ ein, und die Spannungsklemme verwendet negative Rückkopplung, um die Zelle auf dieser Spannung zu halten. Die Elektroden sind an einen Verstärker angeschlossen, der das Membranpotential misst und das Signal in einen Rückkopplungsverstärker einspeist. Dieser Verstärker erhält auch einen Eingang vom Signalgenerator, der das Befehlspotential bestimmt, und er subtrahiert das Membranpotential vom Befehlspotential (Vcommand – Vm), vergrößert jeden Unterschied und sendet einen Ausgang an die Stromelektrode. Immer wenn die Zelle von der Haltespannung abweicht, erzeugt der Operationsverstärker ein „Fehlersignal“, das die Differenz zwischen dem Befehlspotential und der tatsächlichen Spannung der Zelle darstellt. Der Rückkopplungskreis leitet Strom in die Zelle, um das Fehlersignal auf Null zu reduzieren. Somit erzeugt der Klemmkreis einen Strom, der dem Ionenstrom gleich und entgegengesetzt ist. Dies kann gemessen werden, wodurch eine genaue Reproduktion der über die Membran fließenden Ströme entsteht.

Cole entwickelte die Spannungsklemmtechnik vor dem Zeitalter der Mikroelektroden, sodass seine beiden Elektroden aus dünnen Drähten bestanden, die um einen isolierenden Stab gewickelt waren. Da diese Art von Elektrode nur in die größten Zellen eingeführt werden konnte, wurden frühe elektrophysiologische Experimente fast ausschließlich an Axonen von Tintenfischen durchgeführt. Tintenfische spritzen Wasserstrahlen ab, wenn sie sich schnell bewegen müssen, beispielsweise wenn sie einem Raubtier entkommen wollen. Um diese Flucht so schnell wie möglich zu gestalten, besitzen sie ein Axon, das einen Durchmesser von bis zu 1 mm erreichen kann (Signale breiten sich in großen Axonen schneller aus). Das Riesenaxon des Tintenfischs war das erste Präparat, mit dem sich ein transmembranärer Strom spannungsklemmen ließ, und es war die Grundlage für Hodgkins und Huxleys bahnbrechende Experimente zu den Eigenschaften des Aktionspotentials.

Variationen der Voltage-Clamp-Technik

Eine ausführlichere Erläuterung der folgenden Techniken finden Sie im Axon Guide. Das Buch ist vergriffen, kann aber von Axon Instruments als PDF heruntergeladen werden.

Zweielektrodenspannung

das Tintenfischaxon gleichmäßig über seine gesamte Länge. Mikroelektroden können nur eine räumliche Punktquelle für Strom darstellen, die unterschiedliche Teile einer unregelmäßig geformten Zelle möglicherweise nicht gleichmäßig beeinflusst.

Einzelelektroden-Spannungsklemme

Dabei wird eine Elektrode in eine Zelle eingesetzt, die sowohl zur Spannungsaufzeichnung als auch zur Stromweiterleitung dient.

Kontinuierliche Einzelelektrodenklemme (SEVC-c)

Hauptartikel: Patch-Clamp

Die „Patch-Clamp“-Technik ermöglicht die Untersuchung einzelner Ionenkanäle. Dabei wird eine Elektrode mit einer relativ großen Spitze (> 1 Mikrometer) verwendet, die eine glatte Oberfläche (anstelle einer scharfen Spitze) hat. Dies ist eine „Patch-Clamp-Elektrode“ (im Gegensatz zu einer „scharfen Elektrode“, die zum Aufspießen von Zellen verwendet wird). Diese Elektrode wird gegen eine Zellmembran gedrückt und durch Saugen wird die Zellmembran in die Elektrodenspitze gezogen. Durch das Saugen bildet die Zelle eine dichte Abdichtung mit der Elektrode (eine „Gigaohm-Abdichtung“, da der Widerstand größer als ein Gigaohm ist).

SEV-c hat den Vorteil, dass man kleine Zellen aufzeichnen kann, die man mit zwei Elektroden nicht durchbohren könnte. Allerdings:

1) Mikroelektroden sind unvollkommene Leiter; sie haben im Allgemeinen einen Widerstand von mehr als einer Million Ohm. Sie richten gleich (d. h. ändern ihren Widerstand mit der Spannung, oft auf unregelmäßige Weise); manchmal haben sie einen instabilen Widerstand, wenn sie durch Zellinhalte verstopft sind. Daher zeichnen sie die Spannung der Zelle nicht zuverlässig auf, insbesondere wenn sie sich schnell ändert, und sie leiten auch keinen zuverlässigen Strom weiter.

2) Spannungs- und Stromfehler: Die SEV-c-Schaltung misst nicht wirklich die Spannung der geklemmten Zelle (wie dies bei einer Zweielektrodenklemme der Fall ist). Der Patch-Clamp-Verstärker ist wie eine Zweielektrodenklemme, außer dass die Spannungsmess- und Stromdurchleitungsschaltungen verbunden sind (bei der Zweielektrodenklemme sind sie durch die Zelle verbunden). Die Elektrode ist an einem Draht befestigt, der die Strom-/Spannungsschleife im Verstärker berührt. Somit hat die Elektrode nur einen indirekten Einfluss auf die Rückkopplungsschaltung. Der Verstärker liest nur die Spannung an der Oberseite der Elektrode und speist Strom zurück, um dies auszugleichen. Wenn die Elektrode jedoch ein unvollkommener Leiter ist, hat die Klemmschaltung nur eine verzerrte Sicht auf das Membranpotential. Wenn die Schaltung Strom zurückleitet, um diese (verzerrte) Spannung auszugleichen, wird der Strom durch die Elektrode verzerrt, bevor er die Zelle erreicht. Um dies auszugleichen, verwendet der Elektrophysiologe eine Elektrode mit möglichst geringem Widerstand, stellt sicher, dass sich die Elektrodeneigenschaften während eines Experiments nicht ändern (sodass die Fehler konstant bleiben) und vermeidet die Aufzeichnung von Strömen mit einer Kinetik, die wahrscheinlich zu schnell ist, als dass die Klemme sie genau verfolgen könnte. Die Genauigkeit von SEV-c steigt, je langsamer und kleiner die Spannungsänderungen sind, die es zu klemmen versucht.

 

3) Serienwiderstandsfehler: Die an die Zelle geleiteten Ströme müssen zur Erde geleitet werden, um den Stromkreis zu schließen. Die Spannungen werden vom Verstärker relativ zur Erde aufgezeichnet. Wenn eine Zelle auf ihrem natürlichen Ruhepotential geklemmt ist, gibt es kein Problem; die Klemme leitet keinen Strom und die Spannung wird nur von der Zelle erzeugt. Aber wenn bei einem anderen Potential geklemmt wird, werden Serienwiderstandsfehler zu einem Problem; die Zelle leitet Strom über ihre Membran, um zu ihrem natürlichen Ruhepotential zurückzukehren. Der Klemmverstärker wirkt dem entgegen, indem er Strom leitet, um das Haltepotential aufrechtzuerhalten. Ein Problem entsteht, weil sich die Elektrode zwischen dem Verstärker und der Zelle befindet, d. h. die Elektrode ist in Reihe mit dem Widerstand, der die Membran der Zelle ist. Wenn also Strom durch die Elektrode und die Zelle fließt, sagt uns das Ohmsche Gesetz, dass dies dazu führt, dass sich sowohl über den Widerstand der Zelle als auch über den Widerstand der Elektrode eine Spannung bildet. Da diese Widerstände in Reihe geschaltet sind, addieren sich die Spannungsabfälle. Wenn die Elektrode und die Zellmembran den gleichen Widerstand haben (was normalerweise nicht der Fall ist) und der Experimentator eine Änderung von 40 mV vom Ruhepotential anordnet, lässt der Verstärker genügend Strom durch, bis er anzeigt, dass er diese Änderung von 40 mV erreicht hat. In diesem Beispiel erfolgt der Spannungsabfall jedoch zur Hälfte über die Elektrode. Der Experimentator glaubt, er oder sie habe die Zellspannung um 40 mV geändert, hat sie aber nur um 20 mV geändert. Die Differenz ist der „Serienwiderstandsfehler“. Moderne Patch-Clamp-Verstärker verfügen über Schaltkreise, um diesen Fehler zu kompensieren, aber diese kompensieren nur 70-80 % davon. Der Elektrophysiologe kann den Fehler weiter reduzieren, indem er bei oder nahe dem natürlichen Ruhepotential der Zelle aufzeichnet und eine Elektrode mit möglichst geringem Widerstand verwendet.

4) Kapazitätsfehler. Mikroelektroden sind Kondensatoren und besonders problematisch, weil sie nicht linear sind. Die Kapazität entsteht, weil der Elektrolyt im Inneren der Elektrode durch einen Isolator (Glas) von der Lösung außen getrennt ist. Dies ist per Definition und Funktion ein Kondensator. Schlimmer noch: Da sich die Dicke des Glases ändert, je weiter man sich von der Spitze entfernt, ändert sich die Zeitkonstante des Kondensators. Dies führt zu einer verzerrten Aufzeichnung der Membranspannung oder des Membranstroms, wann immer sie sich ändern. Verstärker können dies kompensieren, aber nicht vollständig, da die Kapazität viele Zeitkonstanten hat. Der Experimentator kann das Problem verringern, indem er die Badlösung der Zelle flach hält (wodurch weniger Glasoberfläche der Flüssigkeit ausgesetzt wird) und indem er die Elektrode mit Silikon, Harz, Farbe oder einer anderen Substanz beschichtet, die den Abstand zwischen der inneren und äußeren Lösung vergrößert.

5) Space-Clamp-Fehler. Eine einzelne Elektrode ist eine punktförmige Stromquelle. In entfernten Teilen der Zelle ist der durch die Elektrode fließende Strom weniger einflussreich als in nahegelegenen Teilen der Zelle. Dies ist insbesondere dann ein Problem, wenn Aufzeichnungen von Neuronen mit komplexen dendritischen Strukturen gemacht werden. Gegen Space-Clamp-Fehler kann man nichts tun, außer die Schlussfolgerungen des Experiments abzuschwächen.

Diskontinuierliche Einzelelektroden-Spannungsklemme

Eine diskontinuierliche Einzelelektroden-Spannungsklemme oder SEVC-d hat gegenüber SEVC-c einige Vorteile für die Aufzeichnung der gesamten Zelle. Dabei wird ein anderer Ansatz für die Stromdurchleitung und die Aufzeichnung der Spannung verfolgt. Ein SEVC-d-Verstärker oszilliert zwischen Stromdurchleitung und Spannungsmessung. Eine Oszillation ist ein „Arbeitszyklus“. Während eines Zyklus misst der Verstärker das Membranpotential und vergleicht es mit dem Haltepotential. Ein Operationsverstärker misst die Differenz und erzeugt ein Fehlersignal. Dieser Strom ist ein Spiegelbild des von der Zelle erzeugten Stroms. Die Verstärkerausgänge verfügen über Abtast- und Halteschaltungen, sodass jede kurz abgetastete Spannung dann am Ausgang gehalten wird, bis die nächste Messung im nächsten Zyklus erfolgt. Genauer gesagt misst der Verstärker die Spannung in den ersten paar Millisekunden des Zyklus, erzeugt das Fehlersignal und verbringt den Rest des Zyklus damit, Strom durchzulassen, um diesen Fehler zu reduzieren. Zu Beginn des nächsten Zyklus wird die Spannung erneut gemessen, ein neues Fehlersignal generiert, Strom weitergeleitet usw. Der Experimentator legt die Zykluslänge fest und es ist möglich, alle 500–333 Mikrosekunden eine Probenahme durchzuführen.

Damit dies funktioniert, muss die Zellkapazität um mindestens eine Größenordnung höher sein als die Elektrodenkapazität. Die Kapazität verlangsamt die Kinetik (die Anstiegs- und Abfallzeiten) von Strömen. Wenn die Elektrodenkapazität viel geringer ist als die der Zelle, dann ändert sich die Elektrodenspannung schneller als die Zellspannung, wenn Strom durch die Elektrode fließt. Wenn Sie also Strom einspeisen und ihn dann abschalten (am Ende eines Arbeitszyklus), fällt die Elektrodenspannung schneller ab als die Zellspannung. Sobald die Elektrodenspannung asymptotisch zur Zellspannung ansteigt, kann die Spannung (erneut) abgetastet und der nächste Strombolus angelegt werden. Somit ist die Frequenz des Arbeitszyklus auf die Geschwindigkeit begrenzt, mit der die Elektrodenspannung beim Durchfließen von Strom steigt und abfällt. Je geringer die Elektrodenkapazität, desto schneller kann ein Zyklus ausgeführt werden.

SEVC-d hat gegenüber SEVC-c den großen Vorteil, dass der Experimentator das Membranpotential messen kann. Da es das gleichzeitige Durchleiten von Strom und Messen von Spannung überflüssig macht, tritt nie ein Serienwiderstandsfehler auf. Die Hauptnachteile sind, dass die Zeitauflösung begrenzt und der Verstärker instabil ist. Wenn er zu viel Strom durchlässt, sodass die Zielspannung überschritten wird, kehrt er die Polarität des Stroms im nächsten Arbeitszyklus um. Dies führt dazu, dass er die Zielspannung unterschreitet, sodass der nächste Zyklus die Polarität des eingespeisten Stroms erneut umkehrt. Dieser Fehler kann mit jedem Zyklus größer werden, bis der Verstärker außer Kontrolle gerät („Klingeln“); dies führt normalerweise zur Zerstörung der aufgezeichneten Zelle. Der Forscher möchte einen kurzen Arbeitszyklus, um die zeitliche Auflösung zu verbessern; der Verstärker verfügt über einstellbare Kompensatoren, die die Elektrodenspannung schneller abfallen lassen, aber wenn diese zu hoch eingestellt sind, klingelt der Verstärker, sodass der Forscher immer versucht, den Verstärker so nah wie möglich an die Grenze der unkontrollierten Schwingung „einzustellen“, in welchem ​​Fall kleine Änderungen der Aufzeichnungsbedingungen ein Klingeln verursachen können. Es gibt zwei Lösungen: Entweder Sie nehmen die Verstärkereinstellungen wieder in einen sicheren Bereich zurück oder Sie achten auf Anzeichen dafür, dass der Verstärker kurz vor dem Klingeln steht.

Verweise

1. Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM [2000] Principles of Neural Science, 4. Aufl. S. 152-153. McGraw-Hill, New York
2. Bear, Mark F.; Connors, Barry W.; Paradiso, Michael A. [1996] (15.02.2006). „Kapitel 4 – Das Aktionspotential“, Neuroscience: Exploring the Brain, 3. Auflage, Philadelphia, Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins, 84. ISBN 0-7817-6003-8, LCC QP355.2.B42.
3. Eine kurze Geschichte der Computational Neuroscience, Duke University. Abgerufen am 23. Januar 2007.
4. ab Huxley A (2002) Vom Überschwingen zur Spannungsklemme Trends in Neurosciences 25:553-558

Abgerufen von „http://en.wikipedia.org/wiki/Voltage_clamp“