Ussings „Kämmerlein“: 60+ Jahre alt und es geht weiter

Ussings „Kämmerlein“: 60+ Jahre alt und es geht weiter

Kirk L. Hamilton

Abteilung für Physiologie, Otago School of Medical Sciences, University of Otago, Dunedin, Neuseeland

Ein Kommentar zu

Aktiver Natriumtransport als Stromquelle in der kurzgeschlossenen isolierten Froschhaut
von Ussing, HH, und Zerahn, R. (1951). Acta Physiol. Scand. 23, 110–127.

Im Allgemeinen bezieht sich ein Kommentar zu Frontiers in Physiology auf einen aktuellen Forschungsartikel, der das Potenzial hat, einen bedeutenden Einfluss auf ein bestimmtes wissenschaftliches Forschungsfeld auszuüben. Doch was wäre das Gebiet der Physiologie des epithelialen Ionentransports ohne die Ussing-Kammer? Diese Frage muss man im 100. Jahr der Geburt des großen dänischen Physiologen Hans Henriksen Ussing und seiner berühmten „Kleinen Kammer“ stellen, die mittlerweile über 60 Jahre alt ist.

Die monumentalen Arbeiten von Ussing (1911–2000), die vor fast 65 Jahren begannen, leiteten das „Zeitalter der epithelialen Ionentransportphysiologie“ ein, das bis heute in zahlreichen epithelialen Physiologielabors auf der ganzen Welt floriert. Tatsächlich fasste Lindemann (2001) Ussings Beitrag zur Wissenschaft in vier einfachen Worten zusammen: „… Begründer des epithelialen Transports …“. Palmer und Andersen (2008) zollten Ussing Tribut, indem sie schrieben: „… In gewissem Sinne begann das Feld der epithelialen Polarität 1958 mit dem Artikel von Koefoed-Johnsen und Ussing.“

Der Schwerpunkt dieses Kommentars liegt auf der Hervorhebung der klassischen Arbeit von Hans Ussing, in der er seine mittlerweile berühmte „Kleine Kammer“ und die Implementierung der neuen Kurzschlussstromtechnik verwendete, um den aktiven Transport von Natrium als Quelle elektrischen Stroms über die isolierte Froschhaut zu definieren (Ussing und Zerahn, 1951). Diese einzelne Arbeit führte eine neue Forschungsrichtung ein, die zu unserem Verständnis vieler zellulärer Modelle der Ionentransportphysiologie in zahlreichen Epithelgeweben des Körpers führte. Um die Wirkung von Ussings Arbeit schnell zu ermessen: Gibt man „Ussing“ in PubMed ein, werden zum Zeitpunkt des Verfassens dieses Manuskripts über 2.975 Zitierungen identifiziert. Es gibt zweifellos Hunderte, wenn nicht Tausende anderer Forschungsarbeiten, in denen die Ussing-Kammertechnik verwendet, aber nicht von wissenschaftlichen Suchindizes erfasst wurde. Bezüglich der historischen Perspektive von Ussing und der technischen Details der Ussing-Kammer-Kurzschlusstechnik wird der Leser auf aktuelle Übersichten von Larsen (2002), Palmer und Andersen (2008) sowie Clarke (2009) verwiesen.

Vor der Arbeit von 1951 hatte Ussing durch doppelte Markierung mit Na24 bzw. Na22 festgestellt, dass der Zufluss von Na+ über die Froschhaut höher war als der Abfluss von Na+ (Levi und Ussing, 1949). Ussings Einführung seiner Ussing-Kammer (Ussing und Zerahn, 1951) und die Implementierung der Kurzschlussstromtechnik, bei der er ein isoliertes Froschhautepithel zwischen zwei flüssigkeitsgefüllte Kammern einspannte (Abbildung 1, im Wesentlichen dasselbe Design wie heute; http://www.ussingchamber.com/), war der Beginn eines neuen Forschungszeitalters. Dies ermöglichte die erste Untersuchung der Physiologie des Ionentransports (in diesem Fall Na+) eines Epithels. Die Einspannung des Froschhautepithels zwischen den flüssigkeitsgefüllten Kammern ermöglichte den physischen Zugang zu beiden Seiten der Epithelschicht, um Modulatoren des Ionentransports zu testen. Tatsächlich verwendeten Ussing und Zerahn Kupfer, Adrenalin und einen „Neurohypophysenextrakt“, um die Modulation des Na24-Transports und den Kurzschlussstrom der Froschhaut zu untersuchen. Ussing und Zerahn konnten mit der Kurzschlusstechnik die Gewebe kurzschließen, indem sie jeden erzeugten transepithelialen Strom auf Null zurücktrieben (Spannungsklemmung). Dieser Strom war ein Hinweis auf einen aktiven Transport, der durch die Nettotransportprozesse bestimmt wurde. Letztendlich zeigten Ussing und Zerahn, dass der Kurzschlussstrom der Froschhaut im Wesentlichen durch den aktiven Transport von Na+ über das Epithel der Froschhaut bestimmt wurde.
ABBILDUNG 1
www.frontiersin.org

Abbildung 1. Diagramm des Ussing-Kammerapparats. Abkürzungen sind: A und A′ sind spannungsempfindliche Elektroden; a sind die Luftleitungen zur Belüftung der Froschhaut; B und B′ sind stromführende Elektroden; C sind die beiden Halbkammern; S ist die Stelle, an der die Haut zwischen die Halbkammern geschoben wird; D ist die Batterie und W der Spannungsteiler, die verwendet werden, um (mithilfe von Strom) die Spannung über der Haut so einzustellen, dass sie gleich Null (d. h. kurzgeschlossen) ist, gemessen mit P dem Potentiometer (Voltmeter); jeglicher Strom, der durch die Haut fließt, während die Haut kurzgeschlossen ist, wird mit M dem Mikroamperemeter gemessen und ist der Kurzschlussstrom (μA), also aktiver Transport. Die Reproduktion von Abbildung 1 von Ussing und Zerahn (1951) erfolgt mit freundlicher Genehmigung von John Wiley and Sons.

Die Arbeit von Ussing und Zerahn (1951) bringt fünf wichtige Fortschritte. Erstens haben Ussing und Zerahn die Kurzschlusstechnik auf ein Epithelgewebepräparat angewendet. Zweitens beschreiben sie die Vorrichtung (die Ussing-Kammer), die es ihnen ermöglichte, die gleichzeitige Messung des Na+-Transports und des elektrischen Stroms durch die Froschhaut zu bestimmen. Drittens haben Ussing und Zerahn die Froschhaut mit identischen Lösungen (Ringer-Lösung mit hohem NaCl-Gehalt) gebadet, sodass es keinen passiven Ionenfluss gibt. Daher werden Ionen, die durch aktiven Transport bewegt werden, weiter transportiert und der beobachtete Kurzschlussstrom wird aus einem Nettotransport dieser Ionen resultieren. Viertens haben Ussing und Zerahn eine Hypothese entwickelt, mit der es möglich ist, die elektromotorische Kraft für Na+ und auch den Widerstand gegen den Na+-Strom aus dem Ausfluss von Na+ und dem Kurzschlussstrom zu berechnen. Schließlich berichteten sie, dass der Kurzschlussstrom der Froschhaut im Wesentlichen der Netto-Aktivtransport von Na+ war, basierend auf den Na24-Experimenten im Vergleich zu den Kurzschlussstrommessungen. Mit anderen Worten: Der Na+-Einstrom über das gesamte Hautepithel des Frosches (vom Teichwasser ins Blut) dominierte den Na+-Ausstrom, während nur sehr wenig Na+ aus dem Blut ins Teichwasser transportiert wurde.
Implikationen des Papiers von 1951

Die erste Beschreibung, dass Na+ die elektrische Grundlage des Kurzschlussstroms ist, veranlasste Ussing dazu, ein zelluläres Modell für die Absorption von Na+ durch das Hautepithel des Frosches vorzuschlagen, das das Thema seiner klassischen Arbeit von 1958 war (Koefoed-Johnsen und Ussing, 1958). Palmer und Andersen (2008) haben kürzlich die Arbeit von 1958 ausführlich besprochen.

Kurz gesagt besteht das wesentliche Merkmal von Ussings Zellmodell der Na+-Absorption von Epithelien darin, dass die Epithelzelle (eine schwarze Box) als zwei in Reihe angeordnete Membranen betrachtet wird, die durch ein intrazelluläres Kompartiment getrennt sind. Die Anatomie von Epithelzellen unterscheidet sich stark von der von Muskel- oder Nervenzellen. Wir wissen heute, dass Epithelzellen polarisiert sind, da sich die Transportproteine, die sich in der apikalen Membran befinden, deutlich von denen der basolateralen Membran unterscheiden. Diese Transportproteine ​​erfüllen gemeinsam eine bestimmte Transportaufgabe, wie zum Beispiel die Na+-Reabsorption durch die Sammelrohrzelle des Nephrons. Ussings anfängliche Arbeit mit der Froschhaut hat über zwei Generationen von Wissenschaftlern dazu gebracht, dieses Konzept der „polarisierten“ Zellen zu verstehen. Ussing und Koefoed-Johnsen sagten voraus, dass sich Na+ passiv über die „äußere“ Oberfläche (apikale Membran) der Froschhaut bewegt, dass der Transport jedoch hochselektiv ist. Daher bewegt sich Na+ entlang seines Konzentrationsgradienten in die Zelle hinein. Sie schlugen vor, dass der aktive Transport von Na+ an der „nach innen gerichteten Membran“ (basolateral) der Epithelzelle stattfand. Darüber hinaus schrieben Koefoed-Johnsen und Ussing, dass ein „…erzwungener Austausch von Na+ gegen K+…“ (d. h. Na+/K+-ATPase) über die basolaterale Membran stattfand und es einen Weg für K+ gab, die Zelle über die basolaterale Membran zu verlassen. Interessanterweise hatte Ussing (1947) zuvor vorgeschlagen, dass sich Na+ gegen seinen eigenen Konzentrationsgradienten und ein elektrisches Potenzial bewegt. Die Na+/K+-ATPase hält die niedrige zelluläre Na+-Konzentration und die hohe extrazelluläre Na+-Konzentration aufrecht, um die treibende Kraft für den Eintritt von Na+ über die apikale Membran (äußere Membran der Froschhaut) aufrechtzuerhalten.

Das Zellmodell der epithelialen Na+-Absorption von Koefoed-Johnsen und Ussing wurde im Laufe der Jahre in zahlreichen Epithelgeweben wiederholt bestätigt und erweitert. Zu den untersuchten Geweben gehören die Harnblase von Amphibien und Säugetieren, der distale Dickdarm, verschiedene Abschnitte des distalen Nephrons von Säugetieren, respiratorische Epithelien, Schweißkanäle und zahlreiche kultivierte Zelllinien, die aus verschiedenen dichten, absorptiven Epithelgeweben stammen.

Ussings (Koefoed-Johnsen und Ussing, 1958) Annahme, dass „… die Natriumbewegung durch die äußere Grenze passiv, aber hoch selektiv ist …“, wurde schließlich durch Fluktuationsanalyse-Experimente von Lindemann und Van Driessche (1977) weiter untermauert. In diesen Experimenten schlugen sie vor, dass natriumspezifische Membrankanäle in der Froschhaut durch Amilorid blockiert werden. Der experimentelle Beweis für durch Amilorid hemmbare epitheliale Na+-Kanäle wurde jedoch schließlich durch Patch-Clamp-Studien von Hamilton und Eaton (1985, 1986) sowie Palmer und Frindt (1986) bestätigt. Über 35 Jahre nachdem Koefoed-Johnsen und Ussing ihr Modell veröffentlicht hatten, identifizierten molekulare Studien von Canessa et al. (1993, 1994) die Gene für den epithelialen Na+-Kanal, der heute einfach als ENaC bekannt ist.

Selbst im molekularen Zeitalter der Physiologie des epithelialen Ionentransports greifen Wissenschaftler immer noch auf die Kurzschlussstromtechnik der Ussing-Kammer zurück, um die funktionelle Expression von Kanalproteinen (z. B. Na+-Absorption, Cl−- und K+-Sekretion) und elektrogenen Transportproteinen (z. B. Co-Transporter für Na+-Lösungsstoffe, Co-Transporter für Na+-Aminosäuren) und sogar elektroneutralen Transportern (z. B. Propionatabsorption) nachzuweisen. Die Einfachheit der Kurzschlussstromtechnik der Ussing-Kammer eignet sich für die Untersuchung vieler Aspekte der Physiologie des epithelialen Ionentransports.
Abschließende Gedanken

Es ist schwer vorstellbar, wo das Gebiet der Epithelphysiologie im 21. Jahrhundert stehen würde, wenn Ussing nicht beschlossen hätte, die „Teichwasserumgebung“ des Frosches mit seinen flüssigkeitsgefüllten Kammern nachzubilden. Wir sind von der „Black Box“ einer Epithelzelle der 1950er Jahre zur Beschreibung vieler komplizierter Ionentransport-/Zellmechanismen und Signalwege übergegangen, die in den letzten 60 Jahren die Ionentransportphysiologie von Epithelien modulieren. Es ist sehr aufregend, von den zukünftigen Fortschritten in der Epitheltransportphysiologie zu träumen. Ussing hinterließ uns seine „Kleine Kammer“ und viele Gedanken zur Wissenschaft, darunter die folgenden: „… Seien Sie immer bereit, eine Hypothese abzulehnen oder zu ändern, wenn ein Experiment etwas Unerwartetes zeigt.“
Danksagung

Ich danke Dr. Steven Condliffe und zwei anonymen Gutachtern für ihre Kommentare zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des NZ Lottery Board und der Abteilung für Physiologie der University of Otago unterstützt.
Verweise

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Zitat: Hamilton KL (2011) Ussings „kleine Kammer“: 60 Jahre+ alt und es geht weiter. Vorderseite. Physio. 2:6. doi: 10.3389/fphys.2011.00006

Den Originalartikel finden Sie unter: http://www.frontiersin.org/renal_and_epithelial_physiology/10.3389/fphys.2011.00006/full