Das NSAID Glafenin rettet CFTR-Mutanten der Klasse 2 durch Cyclooxygenase-2-Hemmung des Arachidonsäure-Stoffwechselwegs
Die meisten Fälle von Mukoviszidose (CF) werden durch Mutationen der Klasse 2 im Mukoviszidose-Transmembranregulator (CFTR) verursacht. Diese Proteine bewahren einige Kanalfunktionen, bleiben aber im endoplasmatischen Retikulum (ER) erhalten. Eine teilweise Rettung des häufigsten CFTR-Klasse-2-Mutanten, F508del-CFTR, wurde durch die Entwicklung pharmakologischer Chaperone (Tezacaftor und Elexacaftor) erreicht, die CFTR direkt binden. Es ist jedoch nicht klar, ob diese Medikamente alle CFTR-Klasse-2-Mutanten auf ein medizinisch relevantes Niveau retten werden. Wir haben zuvor gezeigt, dass das nichtsteroidale entzündungshemmende Medikament (NSAID) Ibuprofen den F508del-CFTR-Transport korrigieren kann. Hier verwendeten wir RNAi und pharmakologische Inhibitoren, um den Wirkungsmechanismus des NSAID Glafenin zu bestimmen. Mithilfe von zellulären thermischen Stabilitätstests (CETSAs) zeigen wir, dass es sich um einen Proteostasemodulator handelt. Mithilfe medizinischer Chemie haben wir ein Derivat mit einer vierfachen Steigerung der CFTR-Korrekturwirkung identifiziert. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese neuen Arachidonsäure-Signalweg-Inhibitoren schwer zu korrigierende Mutanten der Klasse 2 wie G85E-CFTR > 13 % retten können, also nicht-CF-Zellen in gut differenzierten HBE-Zellen. Die Ergebnisse legen also nahe, dass die gezielte Beeinflussung des Arachidonsäure-Signalwegs eine lohnende Möglichkeit zur Entwicklung von Korrektoren für bestimmte, bisher schwer zu korrigierende CFTR-Mutationen der Klasse 2 sein könnte.
Spannungsklemmstudien an primären menschlichen Bronchialepithelzellen (HBE)
HBE-Zellen wurden auf mit Fibronektin beschichtete Snapwell-Einsätze (Corning, Tewksbury, MA) ausgesät und das apikale Medium wurde nach 24 h entfernt, um eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche herzustellen 68 . Der transepitheliale Widerstand wurde mit einem EVOM-Epithel-Volt-Ohmmeter (World Precision Instr. Sarasota, FL) überwacht und Monoschichten wurden nach 4 Wochen verwendet, als der Widerstand 300–400 Ω cm 2 betrug. HBE-Monoschichten, die F508del-CFTR exprimieren, wurden auf beiden Seiten mit 0,1 % Dimethylsulfoxid (Negativkontrolle) oder 10 μM Testverbindung (außer VX-809; 1 μM) in OptiMEM mit 2 % (v/v) fötalem Rinderserum behandelt. Der Kurzschlussstrom ( I sc) wurde über in modifizierten Ussing-Kammern montierte Monoschichten gemessen und mit einer VCCMC6-Mehrkanal-Strom-Spannungs-Klemme (Physiologic Instruments, San Diego, CA) spannungsgeklemmt.
Die Leitfähigkeit der apikalen Membran wurde funktionell isoliert, indem die basolaterale Membran mit 200 μg/ml Nystatin permeabilisiert und ein Cl - Gradient von apikal nach basolateral angelegt wurde. Die basolaterale Lösung enthielt 1,2 mM NaCl, 115 mM Na-Gluconat, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM MgCl2, 4 mM CaCl2 , 2,4 mM KH2PO4 , 1,24 mM K2HPO4 und 10 mM Glucose (pH 7,4). Die apikale Lösung enthielt 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO3 , 1,2 mM MgCl2 , 1,2 mM CaCl2 , 2,4 mM KH2PO4 , 1,24 mM K2HPO4 und 10 mM Mannitol (pH 7,4). Apikale Glucose wurde durch Mannitol ersetzt, um den durch Na + -Glucose-Kotransport vermittelten Strom zu eliminieren. Die erfolgreiche Permeabilisierung der basolateralen Membran unter diesen Bedingungen war an der Umkehrung von Isc erkennbar. Die Lösungen wurden bei 37°C gehalten und durch Begasung mit 95 % O2/5 % CO2 kontinuierlich gerührt. Die transepitheliale Spannung wurde gemessen und Ströme durch Agarbrücken-Ag/AgCl-Elektroden geleitet. Zur Überwachung des Widerstands wurden alle 90 s Impulse (1 mV Amplitude, 1 s Dauer) abgegeben, und zur Datenerfassung wurde eine PowerLab/8SP-Schnittstelle verwendet. CFTR wurde durch Zugabe von 10 µM Forskolin + 50 µM Genistein zur apikalen Badelösung aktiviert, und der resultierende Isc reagierte empfindlich auf CFTR inh-172 [10 µM] 69 , was bestätigte, dass es durch CFTR vermittelt wurde.