Einrichtung und Kalibrierung der Ussing-Kammer: Grundlagen der TEER-, Isc- und CFTR-Assays (mit Fehlerbehebung)

Dieser Leitfaden beschreibt einen vollständigen, reproduzierbaren Ussing-Workflow – von der Montage und Kalibrierung der Kammer bis zur Durchführung eines kanonischen CFTR-Assays und der präzisen Berechnung von TEER und Isc. Diese Schritt-für-Schritt-Anleitung wurde speziell für Forscher im Bereich des epithelialen Transports entwickelt und hilft, Störungen zu minimieren, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und konsistente Ergebnisse in Publikationsqualität zu gewährleisten.

Was die Ussing-Kammer misst

• Potentialdifferenz (PD): Die transepitheliale Spannung (mV) über das Gewebe oder die Monoschicht.
• Kurzschlussstrom (I _sc ): Nettoionentransport, gemessen bei einer PD-Spannung von 0 mV.
• Transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER): Barriereintegrität, gemessen aus der angelegten Störung und dem resultierenden Strom (Ω·cm² nach Flächennormalisierung).

Bei der Beurteilung der Barrierefunktion (Tight Junctions) sollte der Fokus auf dem TEER liegen. Bei der Bewertung der Ionenkanal- oder CFTR-Aktivität sollte der Kurzschlussstrom (I _{_sc)} unter Spannungsklemmung priorisiert werden.

Checkliste für Einrichtung und Kalibrierung

1. Kammermontage: Dichtungen, O-Ringe und Öffnungsflächen prüfen. Eine korrekte Abdichtung gewährleistet stabile Ausgangswerte. Ein modernes Ussing-Kammersystem wie das EasyMount P2300 vereinfacht die Ausrichtung und verhindert Leckagen.
2. Lösungen: Verwenden Sie frisch zubereitete, pH-ausgeglichene Pufferlösungen. Erwärmen Sie die Lösung vor und halten Sie die Osmolarität auf beiden Seiten konstant.
3. Elektroden und Brücken: Ag/AgCl-Elektroden konditionieren und Agarbrücken nachfüllen (typischerweise 3 M KCl). Luftblasen verursachen Drift – diese vorsichtig entfernen.
4. Nullpunktkalibrierung und Offset: Überprüfen Sie ohne montiertes Gewebe, ob PD ≈ 0 mV beträgt. Nach der Montage klemmen Sie auf 0 mV und bestätigen Sie die Stabilität der Basislinie, bevor Sie Reagenzien hinzufügen.
5. Dichtigkeits- und Blasenprüfung: Durch leichtes Klopfen die Luftblasen entfernen; Dichtungen neu einsetzen, falls die Instabilität anhält.
6. Datenerfassung und Protokollierung: Aufzeichnung mit 2–10 Hz und Annotation jeder Reagenzzugabe. Verwendung einer Datenerfassungssoftware zur automatisierten Normalisierung und zum Export von Grafiken.

Kanonische CFTR-Assay-Sequenz

Für Atemwegs- oder Darmepithelien ist eine typische pharmakologische Sequenz:

1. Amilorid (apikal): Hemmt ENaC — reduziert die Na⁺-Absorption (Abnahme von I _sc ).
2. Forskolin + IBMX: Erhöht cAMP — aktiviert CFTR (Anstieg von I _sc ).
3. CFTR(inh)-172: Blockiert CFTR — bestätigt CFTR-spezifischen Strom (I _sc sinkt wieder ab).

Konstanz ist entscheidend: Reagenzienkonzentration, Zeitpunkt und Seite der Zugabe müssen in allen Experimenten beibehalten werden.

Berechnungen & Normalisierung

I _sc Normalisierung

I sc,norm (µA/cm²) = I sc,raw (µA) ÷ Area (cm²)
Beispiel: 18 µA über eine 0,33 cm² große Öffnung = 54,5 µA/cm².

TEER-Umwandlung

TEER (Ω·cm²) = R measured (Ω) × Area (cm²) − R blank (Ω·cm²)
Subtrahieren Sie stets den Blindwiderstand von einem Einsatz ohne Zellen, der unter identischen Bedingungen gemessen wurde.

Die richtige Hardware auswählen

Für reproduzierbare Ergebnisse kombinieren Sie einen präzisen Spannungs-/Stromklemmenverstärker mit einem robusten, leicht zu reinigenden Ussing-Kammer-System . Ergänzen Sie den Workflow mit einer Datenerfassungssoftware – diese ermöglicht die nahtlose Protokollierung von Ereignissen, die Flächennormalisierung und den Datenexport zur Analyse.

Kurzanleitung zur Fehlerbehebung

Tipp: Dokumentieren Sie stets die Zusammensetzung der Lösung, die Vorgeschichte der Elektrode und die Gewebequelle. Diese Metadaten verbessern die Reproduzierbarkeit bei der erneuten Datenanalyse Monate später erheblich.

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