Cosa sono i morsetti di tensione?

Cosa sono i morsetti di tensione?

Il morsetto di tensione

Il morsetto di tensione definito Wiki

Il clamp di tensione viene utilizzato dagli elettrofisiologi per misurare le correnti ioniche attraverso una membrana neuronale mantenendo la tensione di membrana a un livello impostato. Le membrane neuronali contengono molti tipi diversi di canali ionici, alcuni dei quali sono controllati dalla tensione. Il clamp di tensione consente di manipolare la tensione di membrana indipendentemente dalle correnti ioniche, consentendo di studiare le relazioni corrente-tensione dei canali di membrana.[1]

Il concetto di voltage clamp si deve a Kenneth Cole[2] e George Marmount[3] negli anni '40. Cole scoprì che era possibile utilizzare due elettrodi e un circuito di feedback per mantenere il potenziale di membrana della cellula a un livello impostato dallo sperimentatore.

Alan Hodgkin capì che, per comprendere il flusso di ioni attraverso la membrana, era necessario eliminare le differenze nel potenziale di membrana.[4] Dopo gli esperimenti con il voltage clamp, Hodgkin e Andrew Huxley delinearono le cause ioniche del potenziale d'azione nel 1952, per le quali condivisero il premio Nobel per la fisiologia o la medicina nel 1963.[

Tecnica

Il clamp di tensione è un generatore di corrente con due elettrodi. La tensione transmembrana viene registrata tramite un "elettrodo di tensione", rispetto alla terra, e un "elettrodo di corrente" fa passare la corrente nella cella. Lo sperimentatore imposta una "tensione di mantenimento", o "potenziale di comando", e il clamp di tensione utilizza un feedback negativo per mantenere la cella a questa tensione. Gli elettrodi sono collegati a un amplificatore, che misura il potenziale di membrana e immette il segnale in un amplificatore di feedback. Questo amplificatore riceve anche un input dal generatore di segnale che determina il potenziale di comando e sottrae il potenziale di membrana dal potenziale di comando (Vcomando - Vm), amplifica qualsiasi differenza e invia un output all'elettrodo di corrente. Ogni volta che la cella devia dalla tensione di mantenimento, l'amplificatore operazionale genera un "segnale di errore", ovvero la differenza tra il potenziale di comando e la tensione effettiva della cella. Il circuito di feedback fa passare la corrente nella cella per ridurre il segnale di errore a zero. Pertanto, il circuito di clamp produce una corrente uguale e opposta alla corrente ionica. Ciò può essere misurato, fornendo una riproduzione accurata delle correnti che scorrono attraverso la membrana.

Cole sviluppò la tecnica del clamp di tensione prima dell'era dei microelettrodi, quindi i suoi due elettrodi consistevano in fili sottili attorcigliati attorno a un'asta isolante. Poiché questo tipo di elettrodo poteva essere inserito solo nelle cellule più grandi, i primi esperimenti elettrofisiologici furono condotti quasi esclusivamente sugli assoni di calamaro. I calamari spruzzano getti d'acqua quando devono muoversi rapidamente, come quando scappano da un predatore. Per rendere questa fuga il più veloce possibile, hanno un assone che può raggiungere 1 mm di diametro (i segnali si propagano più rapidamente lungo gli assoni grandi). L'assone gigante di calamaro fu la prima preparazione che poteva essere utilizzata per clampare di tensione una corrente transmembrana, e fu la base degli esperimenti pionieristici di Hodgkin e Huxley sulle proprietà del potenziale d'azione.

Variazioni della tecnica del clamp di tensione

Una discussione più dettagliata delle tecniche sottostanti può essere trovata nell'Axon Guide. Il libro è ora fuori stampa ma può essere scaricato in formato PDF da Axon Instruments.

Tensione a due elettrodi

l'assone del calamaro in modo uniforme lungo tutta la sua lunghezza. I microelettrodi possono fornire solo una sorgente puntiforme spaziale di corrente che potrebbe non influenzare uniformemente diverse parti di una cellula dalla forma irregolare.

Pinza di tensione a singolo elettrodo

In questo caso, un elettrodo viene posizionato all'interno di una cella e svolge sia la funzione di registrazione della tensione sia quella di passaggio della corrente.

Pinza monoelettrodo continua (SEVC-c)

Articolo principale: patch clamp

La tecnica "patch-clamp" consente lo studio di singoli canali ionici. Utilizza un elettrodo con una punta relativamente grande (> 1 micrometro) che ha una superficie liscia (piuttosto che una punta affilata). Questo è un "elettrodo patch-clamp" (a differenza di un "elettrodo affilato" utilizzato per impalare le cellule). Questo elettrodo viene premuto contro una membrana cellulare e viene applicata una suzione per tirare la membrana della cellula all'interno della punta dell'elettrodo. La suzione fa sì che la cellula formi una tenuta stagna con l'elettrodo (una "tenuta gigaohm", poiché la resistenza è superiore a un gigaohm).

Il vantaggio di SEV-c è che puoi registrare da piccole cellule che sarebbero impossibili da impalare con due elettrodi. Tuttavia:

1) I microelettrodi sono conduttori imperfetti; hanno generalmente una resistenza di oltre un milione di ohm. Si rettificano (cioè cambiano la loro resistenza con la tensione, spesso in modo irregolare), a volte hanno una resistenza instabile se intasati dal contenuto della cella. Quindi non registreranno fedelmente la tensione della cella, specialmente quando cambia rapidamente, né faranno passare fedelmente la corrente.

2) Errori di tensione e corrente: il circuito SEV-c non misura effettivamente la tensione della cella che viene bloccata (come fa un morsetto a due elettrodi). L'amplificatore patch-clamp è come un morsetto a due elettrodi, tranne per il fatto che i circuiti di misurazione della tensione e di passaggio della corrente sono collegati (nel morsetto a due elettrodi, sono collegati attraverso la cella). L'elettrodo è collegato a un filo che entra in contatto con il loop corrente/tensione all'interno dell'amplificatore. Quindi l'elettrodo ha solo un'influenza indiretta sul circuito di feedback. L'amplificatore legge solo la tensione nella parte superiore dell'elettrodo e restituisce la corrente per compensare. Ma, se l'elettrodo è un conduttore imperfetto, il circuito di morsetto ha solo una visione distorta del potenziale di membrana. Analogamente, quando il circuito restituisce la corrente per compensare quella tensione (distorta), la corrente verrà distorta dall'elettrodo prima di raggiungere la cella. Per compensare questo, l'elettrofisiologo usa l'elettrodo con la più bassa resistenza possibile, si assicura che le caratteristiche dell'elettrodo non cambino durante un esperimento (quindi gli errori saranno costanti) ed evita di registrare correnti con cinetiche che potrebbero essere troppo veloci perché il clamp possa seguirle con precisione. La precisione di SEV-c aumenta quanto più lenti e piccoli sono i cambiamenti di tensione che sta cercando di clampare.

 

3) Errori di resistenza in serie: le correnti passate alla cella devono andare a terra per completare il circuito. Le tensioni vengono registrate dall'amplificatore rispetto a terra. Quando una cella viene bloccata al suo potenziale di riposo naturale, non c'è problema; il morsetto non sta facendo passare corrente e la tensione viene generata solo dalla cella. Ma quando si blocca a un potenziale diverso, gli errori di resistenza in serie diventano un problema; la cella farà passare corrente attraverso la sua membrana nel tentativo di tornare al suo potenziale di riposo naturale. L'amplificatore di bloccaggio si oppone a questo facendo passare corrente per mantenere il potenziale di mantenimento. Un problema sorge perché l'elettrodo è tra l'amplificatore e la cella, ovvero l'elettrodo è in serie con il resistore che è la membrana della cella. Quindi, quando si fa passare corrente attraverso l'elettrodo e la cella, la legge di Ohm ci dice che ciò causerà la formazione di una tensione attraverso la resistenza della cella e dell'elettrodo. Poiché questi resistori sono in serie, le cadute di tensione si sommeranno. Se l'elettrodo e la membrana cellulare hanno resistenze uguali (cosa che di solito non accade) e se lo sperimentatore comanda una variazione di 40 mV rispetto al potenziale di riposo, l'amplificatore trasmetterà corrente sufficiente finché non leggerà di aver raggiunto quella variazione di 40 mV. Tuttavia, in questo esempio, metà di quella caduta di tensione è attraverso l'elettrodo. Lo sperimentatore pensa di aver spostato la tensione della cella di 40 mV, ma l'ha spostata solo di 20 mV. La differenza è l'"errore di resistenza in serie". I moderni amplificatori patch-clamp hanno circuiti per compensare questo errore, ma ne compensano solo il 70-80%. L'elettrofisiologo può ridurre ulteriormente l'errore registrando al potenziale di riposo naturale della cellula o in prossimità di esso e utilizzando un elettrodo con la resistenza più bassa possibile.

4) Errori di capacità. I ​​microelettrodi sono condensatori e sono particolarmente problematici perché non sono lineari. La capacità si verifica perché l'elettrolita all'interno dell'elettrodo è separato da un isolante (vetro) dalla soluzione esterna. Questo è, per definizione e funzione, un condensatore. Peggio ancora, poiché lo spessore del vetro cambia man mano che ci si allontana dalla punta, la costante di tempo del condensatore varierà. Ciò produce una registrazione distorta della tensione o della corrente della membrana ogni volta che cambiano. Gli amplificatori possono compensare questo, ma non del tutto perché la capacità ha molte costanti di tempo. Lo sperimentatore può ridurre il problema mantenendo la soluzione di bagno della cella poco profonda (esponendo meno superficie di vetro al liquido) e rivestendo l'elettrodo con silicone, resina, vernice o un'altra sostanza che aumenterà la distanza tra le soluzioni interna ed esterna.

5) Errori di space clamp. Un singolo elettrodo è una sorgente puntiforme di corrente. Nelle parti distanti della cellula, la corrente che passa attraverso l'elettrodo sarà meno influente rispetto alle parti vicine della cellula. Questo è un problema in particolare quando si registra da neuroni con elaborate strutture dendritiche. Non c'è nulla che si possa fare riguardo agli errori di space clamp se non moderare le conclusioni dell'esperimento.

Morsetto di tensione discontinuo a singolo elettrodo

Un clamp di tensione a singolo elettrodo, discontinuo, o SEVC-d, presenta alcuni vantaggi rispetto a SEVC-c per la registrazione "whole-cell". In questo caso, viene adottato un approccio diverso per il passaggio di corrente e la registrazione della tensione. Un amplificatore SEVC-d oscilla tra il passaggio di corrente e la misurazione della tensione. Un'oscillazione è un "ciclo di lavoro". Durante un ciclo, l'amplificatore misura il potenziale di membrana e lo confronta con il potenziale di mantenimento. Un amplificatore operazionale misura la differenza e genera un segnale di errore. Questa corrente è un'immagine speculare della corrente generata dalla cella. Le uscite dell'amplificatore sono dotate di circuiti di campionamento e mantenimento, quindi ogni tensione brevemente campionata viene quindi mantenuta sull'uscita fino alla misurazione successiva nel ciclo successivo. Nello specifico, l'amplificatore misura la tensione nei primi millisecondi del ciclo, genera il segnale di errore e trascorre il resto del ciclo facendo passare corrente per ridurre tale errore. All'inizio del ciclo successivo, viene misurata nuovamente la tensione, viene generato un nuovo segnale di errore, passa corrente, ecc. Lo sperimentatore imposta la lunghezza del ciclo ed è possibile effettuare un campionamento ogni 500-333 microsecondi.

Per far funzionare questo, la capacità della cella deve essere superiore alla capacità dell'elettrodo di almeno un ordine di grandezza. La capacità rallenta la cinetica (i tempi di salita e discesa) delle correnti. Se la capacità dell'elettrodo è molto inferiore a quella della cella, quando la corrente passa attraverso l'elettrodo, la tensione dell'elettrodo cambierà più velocemente della tensione della cella. Quindi quando si inietta corrente e poi la si spegne (alla fine di un ciclo di lavoro), la tensione dell'elettrodo decadrà più velocemente della tensione della cella. Non appena la tensione dell'elettrodo asintotica alla tensione della cella, la tensione può essere campionata (di nuovo) e il successivo bolo di corrente applicato. Quindi la frequenza del ciclo di lavoro è limitata alla velocità alla quale la tensione dell'elettrodo sale e scende durante il passaggio della corrente. Più bassa è la capacità dell'elettrodo, più velocemente si può ciclare.

SEVC-d ha un vantaggio importante rispetto a SEVC-c nel consentire allo sperimentatore di misurare il potenziale di membrana e, poiché evita il passaggio di corrente e la misurazione della tensione allo stesso tempo, non si verifica mai un errore di resistenza in serie. Gli svantaggi principali sono che la risoluzione temporale è limitata e l'amplificatore è instabile. Se passa troppa corrente, in modo che la tensione obiettivo venga superata, inverte la polarità della corrente nel ciclo di lavoro successivo. Ciò fa sì che la tensione al di sotto di quella obiettivo venga superata, quindi il ciclo successivo inverte nuovamente la polarità della corrente iniettata. Questo errore può aumentare a ogni ciclo fino a quando l'amplificatore oscilla fuori controllo ("ringing"); questo di solito provoca la distruzione della cella in fase di registrazione. L'investigatore desidera un ciclo di lavoro breve per migliorare la risoluzione temporale; l'amplificatore ha compensatori regolabili che faranno decadere più rapidamente la tensione dell'elettrodo, ma se questi sono impostati troppo alti l'amplificatore risuonerà, quindi l'investigatore cerca sempre di "sintonizzare" l'amplificatore il più vicino possibile al limite dell'oscillazione incontrollata, nel qual caso piccoli cambiamenti nelle condizioni di registrazione possono causare il ringing. Esistono due soluzioni: "ridurre" le impostazioni dell'amplificatore a un intervallo sicuro oppure prestare attenzione ai segnali che indicano che l'amplificatore sta per suonare.

Riferimenti

1. Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM [2000] Principi della scienza neurale, 4a ed. pp.152-153. McGraw-Hill, New York
2. Bear, Mark F.; Connors, Barry W.; Paradiso, Michael A. [1996] (2006-02-15). "Capitolo 4 - Il potenziale d'azione", Neuroscience: Exploring the Brain, 3a edizione, Philadelphia, Baltimora: Lippincott Williams & Wilkins, 84. ISBN 0-7817-6003-8, LCC QP355.2.B42.
3. Breve storia della neuroscienza computazionale Duke University. Recuperato il 23 gennaio 2007.
4. ab Huxley A (2002) Da overshoot a voltage clamp Trends in Neurosciences 25:553-558

Recuperato da "http://en.wikipedia.org/wiki/Voltage_clamp"