La “piccola camera” di Ussing: oltre 60 anni e contando
La “piccola camera” di Ussing: oltre 60 anni e contando
di Kirk L. Hamilton
Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Scienze Mediche di Otago, Università di Otago, Dunedin, Nuova Zelanda
Un commento su
Trasporto attivo di sodio come fonte di corrente elettrica nella pelle di rana isolata in cortocircuito
di Ussing, HH, e Zerahn, R. (1951). Acta Physiol. Scand. 23, 110–127.
In genere, un Commentary for the Frontiers in Physiology è mirato a un articolo di ricerca recente che ha il potenziale per avere un impatto importante su un particolare campo di ricerca scientifica. Tuttavia, dove sarebbe il campo della fisiologia del trasporto ionico epiteliale senza la camera di Ussing? Bisogna porsi questa domanda nel 100° anniversario della nascita del grande fisiologo danese Hans Henriksen Ussing e della sua famosa "Little Chamber"; che ha ormai più di 60 anni.
Le monumentali opere di Ussing (1911-2000), iniziate quasi 65 anni fa, hanno inaugurato "l'era della fisiologia del trasporto ionico epiteliale", che è ancora fiorente oggi in numerosi laboratori di fisiologia epiteliale in tutto il mondo. In effetti, Lindemann (2001) ha sintetizzato il contributo di Ussing alla scienza in quattro semplici parole "...fondatore del trasporto epiteliale..." Palmer e Andersen (2008) hanno reso omaggio a Ussing scrivendo "...In un certo senso il campo della polarità epiteliale è iniziato nel 1958 con il documento di Koefoed-Johnsen e Ussing".
L'obiettivo di questo Commento è quello di evidenziare il classico articolo di Hans Ussing in cui ha utilizzato la sua ormai famosa "Little Chamber" e l'implementazione della nascente tecnica della corrente di cortocircuito per definire il trasporto attivo di sodio come fonte di corrente elettrica attraverso la pelle isolata della rana (Ussing e Zerahn, 1951). Questo singolo articolo ha introdotto una nuova direzione di ricerca che ha portato alla nostra comprensione di molti modelli cellulari di fisiologia del trasporto di ioni in numerosi tessuti epiteliali del corpo. In particolare, per apprezzare rapidamente l'impatto del lavoro di Ussing, se si digita "Ussing" in PubMed vengono identificate oltre 2.975 citazioni al momento della stesura di questo manoscritto. Ci sono senza dubbio centinaia, se non migliaia; di altri articoli di ricerca in cui è stata utilizzata la tecnica della camera di Ussing ma non catturati dagli indici di ricerca scientifica. Per la prospettiva storica di Ussing e i dettagli tecnici della tecnica di cortocircuito della camera di Ussing, il lettore è invitato a consultare le recenti revisioni di Larsen (2002), Palmer e Andersen (2008) e Clarke (2009).
Prima del documento del 1951, Ussing aveva stabilito che l'afflusso di trasporto di Na+ attraverso la pelle della rana era più alto del flusso di uscita di Na+ utilizzando la doppia etichettatura con Na24 e Na22, rispettivamente (Levi e Ussing, 1949). L'introduzione da parte di Ussing della sua camera di Ussing (Ussing e Zerahn, 1951) e l'implementazione della tecnica della corrente di cortocircuito in cui montò un epitelio di pelle di rana isolato tra due camere piene di liquido (Figura 1, essenzialmente lo stesso design utilizzato oggi; http://www.ussingchamber.com/) fu l'inizio di una nuova era di ricerca. Ciò consentì la prima indagine sulla fisiologia del trasporto di ioni (Na+, in questo caso) di un epitelio. Il montaggio dell'epitelio di pelle di rana tra le camere piene di liquido consentì l'accesso fisico a entrambi i lati dello strato epiteliale per testare i modulatori del trasporto di ioni. In effetti, Ussing e Zerahn hanno utilizzato rame, adrenalina e un "estratto neuroipofisario" per esaminare la modulazione del trasporto di Na24 e la corrente di cortocircuito della pelle di rana. Ussing e Zerahn, utilizzando la tecnica del cortocircuito, sono stati in grado di cortocircuitare i tessuti riportando a zero (tensione di clamping) qualsiasi corrente transepiteliale generata. Questa corrente era indicativa del trasporto attivo determinato dai processi di trasporto netto. In definitiva, Ussing e Zerahn hanno dimostrato che la corrente di cortocircuito della pelle di rana era essenzialmente determinata dal trasporto attivo di Na+ attraverso l'epitelio della pelle di rana.
FIGURA 1
www.frontiersin.org
Figura 1. Diagramma dell'apparato della camera di Ussing. Le abbreviazioni sono: A e A′ sono elettrodi di rilevamento della tensione; a sono le linee d'aria per aerare la pelle della rana; B e B′ sono elettrodi di passaggio della corrente; C sono le due semicamere; S è dove la pelle è inserita tra le semicamere; D è la batteria e W il partitore di potenziale che vengono utilizzati per regolare (utilizzando la corrente) la tensione attraverso la pelle in modo che sia uguale a zero (cioè, cortocircuitata) come misurato da P il potenziometro (voltmetro); qualsiasi corrente che passa attraverso la pelle mentre la pelle è in cortocircuito è misurata da M il microamperometro ed è la corrente in cortocircuito (μA), quindi, trasporto attivo. La riproduzione della Figura 1 da Ussing e Zerahn (1951) è con la gentile autorizzazione di John Wiley and Sons.
Ci sono cinque importanti progressi nel documento di Ussing e Zerahn (1951). In primo luogo, Ussing e Zerahn hanno applicato la tecnica del cortocircuito a una preparazione di tessuto epiteliale. In secondo luogo, descrivono l'apparato (la camera di Ussing) che ha permesso loro di determinare la misurazione simultanea del trasporto di Na+ e della corrente elettrica attraverso la pelle della rana. In terzo luogo, Ussing e Zerahn hanno bagnato la pelle della rana con soluzioni identiche (soluzione di Ringer ad alto contenuto di NaCl), di conseguenza, non ci sarebbe stato alcun flusso di ioni passivi. Pertanto, gli ioni che vengono spostati dal trasporto attivo continueranno e la corrente di cortocircuito osservata risulterà da un trasporto netto di quegli ioni. In quarto luogo, Ussing e Zerahn hanno sviluppato un'ipotesi in cui è possibile calcolare la forza elettromotrice per Na+ e anche la resistenza alla corrente di Na+ dall'efflusso di Na+ e dalla corrente di cortocircuito. Infine, hanno riferito che la corrente di cortocircuito della pelle della rana era essenzialmente il trasporto attivo netto di Na+ basato sugli esperimenti di Na24 confrontati con le misurazioni della corrente di cortocircuito. In altre parole, l'afflusso di Na+ attraverso l'intero epitelio della pelle della rana (dall'acqua dello stagno al sangue) ha dominato l'efflusso di Na+, con una quantità molto ridotta di Na+ trasportata dal sangue all'acqua dello stagno.
Implicazioni del documento del 1951
La descrizione iniziale di Na+ come base elettrica della corrente di cortocircuito ha portato Ussing a proporre il modello cellulare per l'assorbimento di Na+ attraverso l'epitelio della pelle della rana che è stato l'argomento del suo classico articolo del 1958 (Koefoed-Johnsen e Ussing, 1958). Di recente, Palmer e Andersen (2008) hanno eloquentemente esaminato l'articolo del 1958.
In breve, la caratteristica essenziale del modello cellulare di Ussing dell'assorbimento di Na+ degli epiteli è che la cellula epiteliale (una scatola nera) è vista come due membrane disposte in serie separate da un compartimento intracellulare. L'anatomia delle cellule epiteliali è molto diversa da quella delle cellule muscolari o nervose. Ora sappiamo che le cellule epiteliali sono polarizzate, in quanto le proteine di trasporto che risiedono nella membrana apicale sono piuttosto diverse da quelle della membrana basolaterale. Queste proteine di trasporto funzionano, di concerto, per eseguire un compito di trasporto specifico come il riassorbimento di Na+ da parte della cellula del dotto collettore del nefrone, ad esempio. Il lavoro iniziale di Ussing con la pelle di rana ha portato oltre due generazioni di scienziati a comprendere questo concetto di cellule "polarizzate". Ussing e Koefoed-Johnsen hanno previsto che Na+ si muoveva attraverso la superficie "esterna" (membrana apicale) della pelle di rana in modo passivo, tuttavia, quel trasporto era altamente selettivo. Pertanto, Na+ si sposta nella cellula lungo il suo gradiente di concentrazione. Hanno suggerito che il trasporto attivo di Na+ era localizzato nella "membrana rivolta verso l'interno" (basolaterale) della cellula epiteliale. Inoltre, Koefoed-Johnsen e Ussing hanno scritto che uno "...scambio forzato di Na+ contro K+..." (vale a dire, Na+/K+-ATPasi) si è verificato attraverso la membrana basolaterale e c'era un percorso per K+ per uscire dalla cellula attraverso la membrana basolaterale. È interessante notare che Ussing (1947) aveva precedentemente suggerito che Na+ si muoveva contro il proprio gradiente di concentrazione e un potenziale elettrico. La Na+/K+-ATPasi mantiene la bassa concentrazione cellulare di Na+ e l'alta concentrazione extracellulare di Na+ per aiutare a mantenere la forza motrice per l'ingresso di Na+ attraverso la membrana apicale (membrana esterna della pelle della rana).
Il modello cellulare di assorbimento epiteliale di Na+ di Koefoed-Johnsen e Ussing è stato ripetutamente confermato ed esteso in numerosi tessuti epiteliali nel corso degli anni. I tessuti esaminati includono la vescica urinaria di anfibi e mammiferi, il colon distale, vari segmenti del nefrone distale dei mammiferi, epiteli respiratori, dotti sudoripari e numerose linee cellulari coltivate derivate da vari tessuti epiteliali assorbenti stretti.
Infine, il suggerimento di Ussing (Koefoed-Johnsen e Ussing, 1958) secondo cui "...il movimento del sodio attraverso il bordo esterno è passivo, ma altamente selettivo..." è stato ulteriormente rafforzato dagli esperimenti di analisi delle fluttuazioni di Lindemann e Van Driessche (1977) in cui hanno proposto canali di membrana specifici del sodio bloccati dall'amiloride nella pelle di rana. Tuttavia, la prova sperimentale dei canali epiteliali del Na+ inibibili dall'amiloride è stata infine confermata dagli studi di patch-clamp di Hamilton ed Eaton (1985, 1986) e Palmer e Frindt (1986). Oltre 35 anni dopo che Koefoed-Johnsen e Ussing hanno pubblicato il loro modello, gli studi molecolari di Canessa et al. (1993, 1994) hanno identificato i geni per il canale epiteliale del Na+, ora semplicemente noto come ENaC.
Anche nell'era molecolare della fisiologia del trasporto ionico epiteliale, gli scienziati tornano ancora alla tecnica della corrente di cortocircuito della camera di Ussing per dimostrare l'espressione funzionale delle proteine di canale (assorbimento di Na+; secrezione di Cl− e K+, ad esempio) e delle proteine trasportatrici elettrogeniche (ad esempio, co-trasportatori di soluto Na+, co-trasportatori di aminoacidi Na+) e persino dei trasportatori elettroneutri (ad esempio, assorbimento di propionato). La semplicità della tecnica della corrente di cortocircuito della camera di Ussing si presta all'indagine di molti aspetti della fisiologia del trasporto ionico epiteliale.
Considerazioni conclusive
È difficile immaginare dove sarebbe il campo della fisiologia epiteliale nel ventunesimo secolo se Ussing non avesse deciso di ricreare l'"ambiente di acqua di stagno" della rana con le sue camere piene di liquido. Siamo passati dalla "scatola nera" di una cellula epiteliale degli anni '50 alla descrizione di molti complessi meccanismi di trasporto ionico/cellulari e percorsi di segnalazione che modulano la fisiologia del trasporto ionico degli epiteli negli ultimi 60 anni. È molto emozionante sognare i futuri progressi nella fisiologia del trasporto epiteliale. Ussing ci ha lasciato la sua "Piccola Camera" e con molti pensieri sulla scienza tra cui il seguente "... Siate sempre pronti a rifiutare o modificare un'ipotesi, se un esperimento mostra qualcosa di inaspettato".
Ringraziamenti
Ringrazio il dott. Steven Condliffe e due revisori anonimi per i commenti su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NZ Lottery Board e dal Department of Physiology, University of Otago.
Riferimenti
Canessa, CM, Schild, L., Buell, G., Thorens, B., Gautschi, I., Horisberger, JD, e Rossier, BC (1994). Il canale epiteliale Na+ sensibile all'amiloride è costituito da tre subunità omologhe. Nature 367, 463–467.
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Canessa, CM, Horisberger, JD, e Rossier, BC (1993). Canale del sodio epiteliale correlato alle proteine coinvolte nella neurodegenerazione. Nature 361, 467–470.
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Clarke, LL (2009). Una guida agli studi della camera di Ussing dell'intestino del topo. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, G1151–G1166.
Abstract Pubmed | Testo completo Pubmed
Hamilton, KL, e Eaton, DC (1985). Singole registrazioni da canali del sodio sensibili all'amiloride. Am. J. Physiol. 249, C200–C207.
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Hamilton, KL, e Eaton, DC (1986). Regolazione dei singoli canali del sodio nel tessuto renale: un ruolo nell'omeostasi del sodio. Fed. Proc. 45, 2713–2717.
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Koefoed-Johnsen, V., e Ussing, HH (1958). La natura del potenziale della pelle di rana. Acta Physiol. Scand. 42, 298–308.
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Larsen, EH (2002). Hans H. Ussing-lavoro scientifico: significato e prospettive contemporanee. Biochim. Biophys. Acta 1566, 2–15.
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Levi, H., e Ussing, HH (1949). Potenziale di riposo e movimenti ionici nella pelle di rana. Nature 164, 928.
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Lindemann, B. (2001). Hans Ussing, esperimenti e modelli. J. Membr. Biol. 184, 203–210.
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Lindemann, B., e Van Driessche, W. (1977). Canali di membrana specifici del sodio dei pori della pelle di rana: le fluttuazioni di corrente rivelano un elevato turnover. Science 195, 292–294.
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Palmer, LG e Andersen, OS (2008). Il modello a due membrane del trasporto epiteliale: Koefoed-Johnsen e Ussing (1958). J. Gen. Fisiolo. 132, 607–617.
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Palmer, LG e Frindt, G. (1986). Canali del Na+ sensibili all'amiloride dalla membrana apicale del tubulo collettore corticale del ratto. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2767–2770.
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Ussing, HH (1947). Interpretazione dello scambio di radio-sodio nel muscolo isolato. Nature 160, 262–263.
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Ussing, HH, e Zerahn, K. (1951). Trasporto attivo di sodio come fonte di corrente elettrica nella pelle di rana isolata in cortocircuito, Acta Physiol. Scand. 23, 110–127.
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Citazione: Hamilton KL (2011) La “piccola camera” di Ussing: 60+ anni e contando. Fronte. Fisio. 2:6. doi: 10.3389/fphys.2011.00006
L'articolo originale può essere trovato su: http://www.frontiersin.org/renal_and_epithelial_physiology/10.3389/fphys.2011.00006/full