Il FANS glafenina salva i mutanti CFTR di classe 2 tramite l'inibizione della cicloossigenasi 2 del percorso dell'acido arachidonico
La maggior parte dei casi di fibrosi cistica (FC) è causata da mutazioni di classe 2 nel regolatore transmembrana della fibrosi cistica (CFTR). Queste proteine preservano una certa funzione del canale ma sono trattenute nel reticolo endoplasmatico (ER). Il salvataggio parziale del mutante CFTR di classe 2 più comune, F508del-CFTR, è stato ottenuto attraverso lo sviluppo di chaperoni farmacologici (Tezacaftor ed Elexacaftor) che legano direttamente CFTR. Tuttavia, non è chiaro se questi farmaci salveranno tutti i mutanti CFTR di classe 2 a un livello clinicamente rilevante. Abbiamo precedentemente dimostrato che il farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS) ibuprofene può correggere il traffico F508del-CFTR. Qui, abbiamo utilizzato RNAi e inibitori farmacologici per determinare il meccanismo d'azione del FANS glafenina. Utilizzando saggi di stabilità termica cellulare (CETSA), mostriamo che è un modulatore della proteostasi. Utilizzando la chimica farmaceutica, abbiamo identificato un derivato con un aumento di quattro volte della potenza del correttore CFTR. Inoltre, mostriamo che questi nuovi inibitori del pathway dell'acido arachidonico possono salvare mutanti di classe 2 difficili da correggere, come G85E-CFTR > 13%, quello delle cellule non-CF in cellule HBE ben differenziate. Pertanto, i risultati suggeriscono che prendere di mira il pathway dell'acido arachidonico potrebbe essere un modo redditizio per sviluppare correttori di alcune mutazioni CFTR di classe 2 precedentemente difficili da correggere.
Studi di voltage-clamp di cellule epiteliali bronchiali umane primarie (HBE)
Le cellule HBE sono state seminate su inserti Snapwell rivestiti di fibronectina (Corning, Tewksbury MA) e il mezzo apicale è stato rimosso dopo 24 ore per stabilire un'interfaccia aria-liquido 68 . La resistenza transepiteliale è stata monitorata utilizzando un volt-ohmmetro epiteliale EVOM (World Precision Instr. Sarasota FL) e i monostrati sono stati utilizzati dopo 4 settimane quando la resistenza era di 300–400 Ω cm 2 . I monostrati HBE che esprimevano F508del-CFTR sono stati trattati su entrambi i lati con lo 0,1% di dimetilsolfossido (controllo negativo) o 10 μM di composto di prova (eccetto VX-809; 1 μM) in OptiMEM contenente il 2% (v/v) di siero bovino fetale. La corrente di cortocircuito ( I sc) è stata misurata attraverso monostrati montati in camere di Ussing modificate ed è stata bloccata in tensione utilizzando un morsetto corrente-tensione multicanale VCCMC6 (Physiologic Instruments San Diego CA.).
La conduttanza della membrana apicale è stata isolata funzionalmente permeabilizzando la membrana basolaterale con 200 μg/ml di nistatina e imponendo un gradiente Cl − apicale-basolaterale. La soluzione basolaterale conteneva 1,2 mM di NaCl, 115 mM di Na-gluconato, 25 mM di NaHCO3, 1,2 mM di MgCl 2 , 4 mM di CaCl 2 , 2,4 mM di KH 2 PO 4 , 1,24 mM di K 2 HPO 4 e 10 mM di glucosio (pH 7,4). La soluzione apicale conteneva 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO 3 , 1,2 mM MgCl 2 , 1,2 mM CaCl 2 , 2,4 mM KH 2 PO 4 , 1,24 mM K 2 HPO 4 e 10 mM mannitolo (pH 7,4). Il glucosio apicale è stato sostituito con mannitolo per eliminare la corrente mediata dal cotrasporto Na + -glucosio. La permeabilizzazione riuscita della membrana basolaterale in queste condizioni è stata evidente dall'inversione di I sc. Le soluzioni sono state mantenute a 37 °C e agitate continuamente mediante gassificazione con 95% O2/5% CO2. È stata misurata la tensione transepiteliale e le correnti sono passate attraverso gli elettrodi Ag/AgCl a ponte di agar. Sono stati erogati impulsi (ampiezza 1 mV, durata 1 s) ogni 90 s per monitorare la resistenza, ed è stata utilizzata un'interfaccia PowerLab/8SP per l'acquisizione dei dati. CFTR è stato attivato aggiungendo 10 µM di forskolina + 50 µM di genisteina alla soluzione di bagno apicale, e l'Isc risultante era sensibile a CFTR inh-172 [10 µM] 69 , confermando che era mediato da CFTR.