非甾体抗炎药格拉芬酸通过环氧合酶-2抑制花生四烯酸通路来拯救2类CFTR突变体

大多数囊性纤维化（CF）病例是由囊性纤维化跨膜导管调节蛋白（CFTR）的2类突变引起的。这类突变的蛋白虽然保留了一定的通道功能，但会滞留在内质网（ER）中。通过开发能直接结合CFTR的药理伴侣（如Tezacaftor和Elexacaftor），已经实现了对最常见的2类突变体F508del-CFTR的部分修复。然而，目前尚不清楚这些药物是否能将所有2类CFTR突变体修复到医学相关水平。我们此前已证明，非甾体抗炎药（NSAID）布洛芬可纠正F508del-CFTR的转运问题。在本研究中，我们利用RNA干扰（RNAi）和药理学抑制剂来确定另一种NSAID——格拉芬酸（glafenine）的作用机制。通过细胞热稳定性分析（CETSA），我们发现格拉芬酸是一种蛋白稳态调节剂。借助药物化学方法，我们筛选出一种其衍生物，其CFTR纠正活性提高了四倍。此外，我们还发现这些新型花生四烯酸通路抑制剂可修复难以纠正的2类突变体，如G85E-CFTR，在分化良好的HBE细胞中其表达量可恢复至非CF细胞的13%以上。因此，研究结果表明，靶向花生四烯酸通路可能是开发某些难以纠正的2类CFTR突变修复剂的有效策略。

原代人支气管上皮（HBE）细胞的电压钳研究

HBE细胞接种于涂有纤维连接蛋白的Snapwell插入膜（Corning公司，美国马萨诸塞州特克斯伯里），在培养24小时后去除顶端培养液以建立气-液界面【68】。使用EVOM上皮电阻计（World Precision Instruments，美国佛罗里达州萨拉索塔）监测跨上皮电阻，并在电阻达到300–400 Ω·cm²的第4周使用单层细胞。

表达F508del-CFTR的HBE细胞单层在顶端和基底侧均处理0.1%二甲基亚砜（阴性对照）或10 μM测试化合物（VX-809除外，使用1 μM），处理液为含2%（体积比）胎牛血清的OptiMEM。

短路电流（Isc）在装入改良型Ussing小室的单层细胞上测定，并通过VCCMC6多通道电压-电流钳系统（Physiologic Instruments，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行电压钳操作。

通过使用200 μg/ml制霉菌素（nystatin）使基底侧膜通透，并施加顶端-基底侧Cl⁻梯度，实现对顶端膜电导的功能隔离。基底液中含有：1.2 mM NaCl、115 mM 葡糖酸钠、25 mM NaHCO₃、1.2 mM MgCl₂、4 mM CaCl₂、2.4 mM KH₂PO₄、1.24 mM K₂HPO₄、10 mM 葡萄糖（pH 7.4）。顶端液中含有：115 mM NaCl、25 mM NaHCO₃、1.2 mM MgCl₂、1.2 mM CaCl₂、2.4 mM KH₂PO₄、1.24 mM K₂HPO₄ 和10 mM 甘露醇（pH 7.4）。顶端葡萄糖被甘露醇替代，以消除由于Na⁺-葡萄糖共转运所引起的电流。

在此条件下，基底膜成功通透的表现为Isc的方向发生反转。溶液维持在37 °C，并通过95% O₂/5% CO₂气体搅拌以保持连续流动。跨上皮电压由Ag/AgCl琼脂桥电极测量，通过施加1 mV幅度、1秒持续时间的电脉冲（每90秒一次）监测电阻，使用PowerLab/8SP接口进行数据采集。

通过向顶端灌注液中加入10 µM forskolin + 50 µM genistein激活CFTR，所产生的Isc对CFTR抑制剂inh-172（10 µM）敏感【69】，证实该电流由CFTR介导。