Der vollständige Ussing Chamber Guide

1) Was eine Ussing-Kammer tatsächlich misst und warum

Ziel. Quantifizierung des transepithelialen Transports und der Barriereintegrität über ein Gewebe oder eine Monolage hinweg, die zwei Lösungen trennt (mukosal/apikal vs serosal/basolateral).

Primäre elektrische Messwerte

• PD (Potenzialdifferenz, mV): Leerlaufspannung über dem Epithel.

• Isc (Kurzschlussstrom, µA/cm²): Netto-Aktivionentransport, wenn PD auf 0 mV geklemmt ist.

• TER / TEER (Ω, Ω·cm²): Barrierendichtheit; höhere Werte = dichtere Verbindungen.

  • TEER ist flächennormalisiert : TEER = (R_sample − R_blank) × Area .

Flussmessungen (chemisch)

• Parazellulärer Tracerfluss (z. B. Mannitol, FITC-Dextran, Inulin): Permeabilität von Tight Junctions.

• Transzellulärer Fluss (z. B. Glukose, Aminosäuren): Transporter-vermittelte Aufnahme.

• Scheinbare Permeabilität (Papp) für einen gelösten Stoff:
  Papp = (dQ/dt) / (A × C0)
  wobei dQ/dt = Auftretensrate auf der Empfängerseite, A = Fläche, C0 = Donorkonzentration.

Warum das wichtig ist. Diese Messgrößen bilden die Grundlage für die Forschung in den Bereichen CFTR/ENaC-Physiologie, IBD, Zöliakie, Durchfallmodelle, Atemwegshydratation, Hautbarriere und Arzneimittelabsorption/Toxizität.

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2) Die Physik: PD, Isc und TER verstehen

• Ohmsches Gesetz (Gewebe): V = I × R .

  • Bei einer Spannung von 0 mV entspricht der injizierte Kurzschlussstrom (Isc) dem Nettotransport durch Elektrogenese (z. B. CFTR-vermittelte Cl⁻-Sekretion abzüglich der Na⁺-Absorption durch ENaC).

• Die Serienwiderstände (Lösung + Elektroden + Brücken) befinden sich außerhalb des Gewebes.

  • Eine gute Kammerkonstruktion verwendet spannungsmessende Elektroden in der Nähe des Gewebes, um den Serienabfall zu minimieren.

• AC vs DC TER.

  • Gleichstromimpuls/-schritt : Kurzzeitig einen kleinen Strom einspeisen, ΔV/ΔI berechnen.

  • Wechselstromimpedanz : Eine kleine Sinuswelle (z. B. 1 kHz) kann den Epithelwiderstand und die Kapazität isolieren, sofern die Elektronik dies unterstützt.

Korrekturen, die Sie anwenden sollten

• Flüssigkeitsübergangspotentiale (LJP): entstehen an Lösungsgrenzflächen; sie lassen sich durch Anpassen der Ionenstärke und Verwendung von KCl-Agarbrücken reduzieren.

• Offsetkorrektur: In symmetrischen Lösungen die Messelektroden kurzschließen; vor dem Aufbringen des Gewebes eine Basis-PD von ≈ 0 mV einstellen.

• Flächennormalisierung: µA/cm² (Isc) und Ω·cm² (TEER) werden immer unter Verwendung der wahren Aperturfläche angegeben.

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3) Hardware: Was die einzelnen Komponenten bewirken

Kammern & Schieber (Blenden)

• Klassische Split-Half-Technik = maximale Flexibilität; erfordert mehr Ballfertigkeit.

• EasyMount = geführte, schnelle und wiederholbare Montage; reduziert Gewebeschäden und Variabilität.

• Die Apertur bestimmt die Empfindlichkeit und die Normalisierung (üblich: 0,071–0,64 cm²).

• Dichtungen (Dicke, Nachgiebigkeit) steuern die Kompression; zu festes Anziehen verursacht Leckagen an den Rändern oder Ischämie.

Elektroden und Brücken

• Ag/AgCl-Elektroden über Agar–KCl-Brücken (z. B. 3 M KCl in 2–3 % Agar).

• Die Messelektroden sollten nah am Gewebe, die Stromelektroden weiter entfernt platziert werden.

• Wartung: Ag-Drähte regelmäßig neu chloridieren; trübe oder ausgetrocknete Brücken ersetzen.

Perfusion, Gas, Temperatur

• Gaslift mit 95 % O₂ / 5 % CO₂ (Carbogen) für Bicarbonatpuffer; sanftes Einleiten von Gasblasen reduziert ungerührte Schichten.

• Die Perfusion (konstant oder intervallweise) verhindert Verbrauch/Anreicherung und hält die Medikamente auf der eingestellten Konzentration.

• Temperatur : 37 °C mit Block- oder Inline-Heizelementen und kalibrierten Sonden; bereits eine Drift von 1–2 °C ändert Isc/TEER.

Klemmen & Datenerfassung

• Spannungs-Strom-Klemmen (ein-/mehrkanalig) messen Teilentladungen, speisen Strom ein und berechnen Isc/TER automatisch.

• Datenerfassung : Zeitgestempelte Ereignisse, Protokollschritte und Annotationen sind für die Reproduzierbarkeit entscheidend.

Physiologic Instruments bietet:

• EasyMount- und Classic-Ussing-Kammern (Aperturoptionen; gewebespezifische Schieber).

• VCC-Serienklemmen (z. B. VCC MC8 Mehrkanal) für simultane Experimente mit integrierten Isc/TER-Routinen.

• Perfusionsverteiler, Temperaturregler, Gaslift-Systeme und Ag/AgCl-Elektrodensätze , die auf die Kammern abgestimmt sind.

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4) Lösungen & Rezepte (Praxisbeispiele)

Bitte prüfen Sie dies mit Ihrer Ethikkommission (IACUC/IRB/SOP). Die Pufferzusammensetzung beeinflusst LJPs, Transportkräfte und die Lebensfähigkeit.

Krebs-Ringer-Bicarbonat (typisch)

• NaCl 117 mM, KCl 4,7 mM, CaCl₂ 2,5 mM, MgSO₄ 1,2 mM, KH₂PO₄ 1,2 mM, NaHCO₃ 25 mM, Glucose 10 mM

• Gas mit 95 % O₂ / 5 % CO₂ , 37 °C.

Mannitol/Glucose-Osmotische Paarung (für symmetrische Osmolalität)

• Serosal: Glucose 10 mM; Mukosal: Mannitol 10 mM (oder umgekehrt), um Transportasymmetrien zu isolieren.

Gängige Modulatoren

• Amilorid (apikal) zur Blockierung von ENaC (↓ Na⁺-Absorption).

• Forskolin/IBMX (stimulieren cAMP → ↑ CFTR-vermittelte Cl⁻-Sekretion).

• Bumetanid (basolateral) zur Blockierung von NKCC1 (begrenzt die Cl⁻-Beladung → ↓ Sekretion).

• CFTRinh-172 zur Hemmung der CFTR-Ströme.

Tracer-Beispiele für Fluss

• Parazellulär: Mannitol, FITC-Dextran (3–4 kDa) .

• Transzellulär: radioaktiv markierte Glukose, Aminosäuren (Sicherheitsprotokolle beachten).

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5) Protokoll: Schritt-für-Schritt-Standardarbeitsanweisung (praxiserprobt)

A. Vorlaufprüfungen (10–20 Min.)

1. Elektrodenversatz: Tauchen Sie beide Messspitzen in denselben Puffer; stellen Sie PD ≈ 0 mV ein.

2. Brückengesundheit: sanftes Ansaugen → freier Fluss; keine Blasen.

3. Temperatur: Kammern bei 37 °C (±0,2 °C) stabilisieren.

4. Lösungen: Vorwärmen und Begasen; pH-Wert (7,3–7,4), Osmolalität (±5 mOsm) überprüfen.

5. Blank TER: Mit einer Dichtung/ohne Gewebe montieren, um den Systemwiderstand zu messen, falls Ihre SOP R_blank vorschreibt.

B. Gewebe-/Einlegevorbereitung (variiert je nach Modell)

• Natives Gewebe: Sorgfältig präparieren; Mesenterialrisse vermeiden; entlang der Mesenterialgrenze öffnen; bis zur Öffnung zuschneiden.

• Zellmonolayer (z. B. Transwell): Vor dem Aufbringen spülen und 15–30 min in Aufnahmepuffer äquilibrieren (ggf. Adapterschieber verwenden).

C. Montage (2–5 Min. mit EasyMount; länger mit Classic)

• Gewebe ausrichten (Schleimhaut → apikal, Serosa → basolateral).

• Durch leichtes Zusammendrücken verschließen – keine Falten oder Kantenüberstände .

• Perfusion/Gaszufuhr starten; 10–20 Minuten warten, bis sich der Ausgangswert stabilisiert hat.

D. Erfassung der Ausgangswerte

• Aufzeichnung von PD und Isc im Steady State (Drift <1%/min).

• Messen Sie TER über die ΔI- oder AC-Routine Ihrer Stromzange; berechnen Sie TEER .

E. Interventionen (Beispiele)

1. Amilorid (apikal) → beobachten ↓ Isc (blockiert ENaC).

2. Forskolin/IBMX (bilateral oder basolateral) → ↑ Isc (aktiviert CFTR).

3. Bumetanid (basolateral) → ↓ Sekretionsstrom (blockiert NKCC1).

4. Testsubstanz apikal/serös hinzufügen; PD/Isc im Zeitverlauf verfolgen; Proben für den Fluss sammeln.

F. Flussprobenahme (falls zutreffend)

• Intervalle definieren (z. B. alle 10–15 Minuten); Sinkbedingungen aufrechterhalten (Empfängerseite <10 % der Spenderkonzentration).

• Berechnen Sie Papp und Abstand ; normieren Sie auf Fläche und Zeit.

G. Abverkauf & Qualitätskontrolle

• Überprüfen Sie Offset und Leerzeichen erneut, um die Systemstabilität zu bestätigen.

• Jegliche Abweichungen von Temperatur oder pH-Wert protokollieren; Gewebe auf Beschädigungen an den Rändern untersuchen.

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6) Datenanalyse, Normalisierung und Berichtserstellung

Normalisierung

• Isc zu µA/cm²: durch die Aperturfläche teilen.

• TEER zu Ω·cm²: (R_sample − R_blank) × Area .

• Die Angaben beziehen sich auf den Mittelwert ± SEM , n Tiere und n Gewebe pro Tier ; Pseudoreplikation vermeiden (mehrere Gewebe eines Tieres nicht als unabhängig behandeln, es sei denn, dies ist gerechtfertigt).

Typische Diagramme

• Zeitlicher Verlauf von Isc mit annotierten Ergänzungen.

• TEER-Verlauf vor und nach der Behandlung.

• Fluss (kumulativ oder als Rate) im Zeitverlauf; Balkendiagramme von Papp.

Statistiken

• Paarweise Analyse, wenn dasselbe Gewebe als seine eigene Kontrolle dient.

• Gemischte Modelle für Designs mit mehreren Tieren und Geweben.

• Vordefinierte Ausschlusskriterien (Leckagen, instabile Ausgangswerte).

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7) Fehlerbehebung (Schnelldiagnose)

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8) Versuchsplanung nach Gewebetyp

Darm/Darm

• Bei einem prostaglandinempfindlichen Modell sollte eine Vorinkubation mit Indomethacin (blockiert Prostanoiden) durchgeführt werden.

• Schonende Entfernung des Inhalts über die Schleimhaut; Epithelverletzungen vermeiden.

Atemwege (Luftröhre/Bronchien)

• ENaC-Blockade mit Amilorid (apikal) ; CFTR-Aktivierung über Forskolin/IBMX ; Bumetanid-Sensitivität beobachten.

Haut

• Dickere, höhere TEER-Werte; robuste Abdichtung gewährleisten; längere Ausgleichsphase in Betracht ziehen.

Kultivierte Monolayer (z. B. Caco-2, primäre Atemwegszellen)

• Konfluenz prüfen (Vor-TEER-Schwellenwerte); Adapterschieberegler verwenden; Filterstützwiderstand beachten (Leerwert subtrahieren).

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9) Checkliste für Qualität und Reproduzierbarkeit

• Kammeridentität, Öffnung, Dichtungscharge erfasst

• Temperatur-/pH-Wert-Werte innerhalb des zulässigen Bereichs

• Elektrodenversatz vorher/nachher

• Basisstabilität (Drift <1%/min)

• Korrekte Seitenzusätze und Zeitstempel

• Flächennormalisierung dokumentiert

• Ausschlusskriterien vordefiniert und angewendet

• Rohdateien archiviert (Zeitreihen + Ereignisprotokoll)

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10) Sicherheit und Einhaltung der Vorschriften

• Radiotracer: Lizenzierung, Abschirmung, Wischtests, getrennte Abfallentsorgung.

• Menschliches/tierisches Gewebe: Genehmigungen durch die Ethikkommission/das IBCUC, BSL-2-Vorsichtsmaßnahmen nach Bedarf.

• Chemische Gefahren: Bumetanid, Forskolin, DMSO-Kontrollen, ordnungsgemäßer Zugang zum Sicherheitsdatenblatt.

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11) Auswahl und Budgetierung des richtigen Systems

Zielvorgabe

• Lehrtätigkeit / Pilotarbeit: Einkanal, manuelle Klemme, Basisperfusion.

• Core Lab / Pharma: Mehrkanal (4–8+), automatisierte Abläufe, integrierte Datenerfassung.

• Barriere-Screening: Stabile TEER-Messung mit schneller Montage (EasyMount), zuverlässige Perfusions- und Temperaturkontrolle.

Kostenerwartungen (konfigurationsabhängig)

• Einstiegsmarkt für Einzelkanäle: untere fünfstellige Beträge

• Standard-Mehrkanal: mittlerer bis oberer fünfstelliger Bereich

• Hochdurchsatzautomatisierung: niedriger sechsstelliger Bereich

Physiologische Instrumente können Folgendes spezifizieren:

• EasyMount Ussing Chambers (schnelle, wiederholbare Montage von Gewebe und Monolayern).

• Klassische Kammern (maximale Flexibilität für verschiedene Gewebearten).

• VCC MC8 (Mehrkanal-Clamp) und VCC 600 (Single/Dual) mit integrierten Isc/TER-Routinen.

• Perfusionsverteiler, Inline-Heizgeräte, Gaslift-Kits, Elektroden-/Brücken-Kits und auf die Epithelphysiologie abgestimmte Software .
  Fordern Sie ein detailliertes Angebot an, das auf Ihr Gewebe, Ihre Öffnungsweite und Ihren Durchsatz abgestimmt ist.

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12) Anhänge

A) Schnellstart-Standardarbeitsanweisung (einseitig)

1. Warme/Gas-Puffer; auf 37 °C einstellen.

2. Null-Elektroden in symmetrischem Puffer.

3. Seidenpapier einlegen (faltenfrei, korrekte Ausrichtung).

4. Stabilisieren; PD/Isc-Ausgangswert erfassen; TER → TEER messen.

5. Modulatoren hinzufügen (Amilorid → Forskolin/IBMX → Bumetanid usw.).

6. Sammeln Sie Flussproben planmäßig; halten Sie die Senkenbedingungen aufrecht.

7. Abschluss: Offsets erneut prüfen; Ausnahmen dokumentieren.

B) Allgemeine Berechnungen

• Isc-Dichte: Isc_density (µA/cm²) = Isc_raw (µA) / Area (cm²)

• TEER: TEER (Ω·cm²) = (R_sample − R_blank) × Area

• Papp: Papp = (ΔQ/Δt) / (A × C0)

• Leitwert (Gt): Gt = 1 / R (bei Bedarf auf die Fläche normieren)

C) Berichtsvorlage (Kopieren/Einfügen)

• Gewebe: Spezies/Region; Monolayer-Linie & Passage

• Kammer: Modell, Öffnung (cm²), Dichtungsdicke

• Lösungen: Zusammensetzung, pH-Wert, Temperatur; Gasmischung

• Klemme: Modell, Abtastrate, TER-Methode (DC/AC)

• Ausgangswerte für PD/Isc/TEER ± SEM (n Tiere, n Gewebe/Tier)

• Agonisten/Antagonisten: Seite, Konzentration, Fahrzeugkontrolle

• Fluss: Tracer, Probenahmeplan, Papp-Berechnung

• Statistik: Tests, α-Niveau, Ausschlusskriterien

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13) Warum Forscher physiologische Instrumente wählen

• Speziell für die Epithelphysiologie entwickelt : Kammern, Klemmen und Zubehör, die für das Zusammenspiel konzipiert sind.

• Reproduzierbarkeit durch Design: EasyMount reduziert Handhabungsvarianz; VCC-Klemmen automatisieren wichtige Schritte (Isc/TER-Routinen, Annotationen).

• Unterstützung von Wissenschaftler zu Wissenschaftler: Protokolloptimierung, Aperturauswahl und Hilfe bei der Fehlersuche von Leuten, die diese Experimente durchführen.

• Langlebigkeit & Service: Ersatzteile, Elektroden, Brücken und Upgrades sind erhältlich, um die Systeme über Jahre hinweg spezifikationsgemäß zu halten.

Sind Sie bereit, die Ausstattung Ihres Labors zu spezifizieren oder zu standardisieren? Physiologic Instruments kann Ihnen eine detaillierte Konfiguration anbieten, die auf Ihr Gewebe, Ihre Öffnungsrate, Ihren Durchsatz und Ihre Analysemethode zugeschnitten ist – einschließlich Schulungsempfehlungen und einer Validierungscheckliste.