1) Was eine Ussing-Kammer misst und warum

Ziel: Quantifizierung des transepithelialen Transports und der Barriereintegrität über ein Gewebe oder eine Monoschicht, die apikale und basolaterale Lösungen trennt.

Primäre elektrische Anzeigen

• PD (Potentialdifferenz, mV): Leerlaufspannung über dem Epithel.

• I _sc (Kurzschlussstrom, µA/cm²): Netto-Ionentransport, wenn PD auf 0 mV geklemmt ist.

• TER / TEER (Ω, Ω·cm²): Barrieredichtheit; höhere Werte = dichtere Verbindungen.

  • TEER ist flächennormalisiert : TEER = (R sample − R blank ) × Area

Flussanzeigen (chemisch)

• Parazellulärer Tracerfluss (z. B. Mannitol, FITC-Dextran): Tight-Junction-Permeabilität.

• Transzellulärer Fluss (z. B. Glukose, Aminosäuren): Transporter-vermittelte Aufnahme.

• Scheinbare Permeabilität (P _app ) für einen gelösten Stoff: P app = (dQ/dt) / (A × C 0 )

Warum das wichtig ist: Diese Messwerte bilden die Grundlage für die Forschung in den Bereichen CFTR/ENaC-Physiologie, IBD, Zöliakie, Durchfallmodelle, Atemwegshydratation, Hautbarriere und Arzneimittelabsorption/-toxizität.

2) Die Physik: PD, Isc und TEER verstehen

• Ohmsches Gesetz (Gewebe): V = I × R .

  Bei einer Spannungsbegrenzung auf 0 mV entspricht der injizierte I _sc dem Netto-Elektronentransport (z. B. CFTR-vermittelte Cl⁻-Sekretion minus ENaC Na⁺-Absorption).

• Serienwiderstände (Lösung + Elektroden + Brücken) befinden sich außerhalb des Gewebes. Bei einem guten Kammerdesign werden die spannungsempfindlichen Elektroden nahe am Gewebe platziert, um den Serienabfall zu minimieren.

• AC- vs. DC-TEER.

  • Gleichstromimpuls/-schritt: Geben Sie kurz einen kleinen Strom ein und berechnen Sie ΔV/ΔI.

  • Wechselstromimpedanz: Eine kleine Sinuskurve (z. B. 1 kHz) kann den Epithelwiderstand und die Kapazität isolieren, wenn dies von der Elektronik unterstützt wird.

Anzuwendende Korrekturen

• Liquid Junction Potentials (LJP): Ionenstärke anpassen; KCl-Agarbrücken verwenden.

• Offset-Korrektur: Schließen Sie die Sensorelektroden in symmetrischen Lösungen kurz; stellen Sie vor der Gewebemontage eine Basis-PD von ≈ 0 mV ein.

• Flächennormalisierung: Geben Sie µA/cm² (I _sc ) und Ω·cm² (TEER) immer unter Verwendung der tatsächlichen Aperturfläche an.

3) Ussing Chamber Hardware: Was jede Komponente tut

Kammern und Schieber (Öffnungen)

• Klassische Split-Halfs: maximale Flexibilität, mehr Geschick im Handling erforderlich.
• EasyMount : geführte, schnelle, wiederholbare Montage; reduziert Gewebeschäden und Variabilität.
• Die Blende bestimmt die Empfindlichkeit und Normalisierung (üblich: 0,071–0,64 cm²).
• Dichtungen (Dicke, Nachgiebigkeit) steuern die Kompression; zu festes Anziehen führt zu Randlecks oder Ischämie.

Elektroden & Brücken

• Ag/AgCl-Elektroden über Agar-KCl-Brücken (z. B. 3 M KCl in 2–3 % Agar).
• Halten Sie die Sensorelektroden nahe am Gewebe und die Stromelektroden weiter außen.
• Wartung: Ag-Drähte regelmäßig neu chlorieren; trübe oder dehydrierte Brücken ersetzen.

Perfusion, Gas, Temperatur

• Gaslift mit 95 % O₂ / 5 % CO₂ (Carbogen) für Bicarbonatpuffer; sanftes Blasen reduziert ungerührte Schichten.
• Durch Perfusion (konstant oder Intervall) wird eine Erschöpfung/Akkumulation verhindert und die eingestellte Arzneimittelkonzentration aufrechterhalten.
• Temperatur : 37 °C mit In-Block- oder In-Line-Heizgeräten und kalibrierten Sonden; selbst eine Drift von 1–2 °C ändert I _sc /TEER.

Klemmen und DAQ

• Spannungs-Strom-Klemmen (Einzel-/Mehrkanal) messen PD, injizieren Strom und berechnen I _sc /TEER automatisch.
• Datenerfassung : Mit Zeitstempeln versehene Ereignisse, Protokollschritte und Anmerkungen verbessern die Reproduzierbarkeit.

Suchen Sie nach Systemen? Siehe Ussing-Kammersysteme und das Ussing-Kammerprotokoll .

4) Ussing-Kammerlösungen und -Rezepte (Arbeitsbeispiele)

Überprüfen Sie dies mit Ihrem IACUC/IRB/SOP. Die Pufferchemie beeinflusst LJPs, Transportantriebskräfte und Lebensfähigkeit.

Krebs-Ringer-Bicarbonat (typisch)

• NaCl 117 mM, KCl 4,7 mM, CaCl₂ 2,5 mM, MgSO₄ 1,2 mM, KH₂PO₄ 1,2 mM, NaHCO₃ 25 mM, Glucose 10 mM
• Gas mit 95 % O₂ / 5 % CO₂, 37 °C

Mannitol/Glucose-Osmotisches Paar (symmetrische Osmolalität)

• Serosal: Glucose 10 mM; apikal: Mannitol 10 mM (oder umgekehrt), um Transportasymmetrien zu isolieren.

Gängige Modulatoren

• Amilorid (apikal) → ENaC-Block (↓ Na⁺-Absorption)
• Forskolin/IBMX → ↑ cAMP → ↑ CFTR-vermittelte Cl⁻-Sekretion
• Bumetanid (basolateral) → NKCC1-Block (begrenzt die Cl⁻-Beladung → ↓ Sekretion)
• CFTR inh -172 → hemmt CFTR-Ströme

Tracer-Beispiele für Flussmittel

• Parazellulär: Mannitol, FITC-Dextran (3–4 kDa)
• Transzellulär: radioaktiv markierte Glukose, Aminosäuren (Sicherheitsprotokolle beachten)

5) Ussing-Kammer-Protokoll: Schritt-für-Schritt-SOP (praxiserprobt)

A. Kontrollen vor dem Lauf (10–20 Min.)

1. Elektrodenversatz: Tauchen Sie beide Sensorspitzen in denselben Puffer ein und stellen Sie PD ≈ 0 mV ein.
2. Brückengesundheit: sanftes Saugen → freier Fluss; keine Blasen.
3. Temperatur: Kammern bei 37 °C (±0,2 °C) stabilisieren.
4. Lösungen: vorwärmen und begasen; pH-Wert (7,3–7,4) und Osmolalität (±5 mOsm) überprüfen.
5. Blank TER: Mit einer Dichtung/ohne Gewebe zusammenbauen, wenn SOP ein R- _Blank erfordert.

B. Gewebe-/Einsatzvorbereitung

• Natürliches Gewebe: vorsichtig präparieren, entlang des Mesenterialrandes öffnen, bis zur Öffnung zuschneiden.
• Monoschichten (z. B. Transwell): spülen, 15–30 Minuten äquilibrieren; bei Bedarf Adapterschieber verwenden.

C. Montage (2–5 Min. mit EasyMount)

• Gewebe ausrichten (Schleimhaut → apikal, Serosa → basolateral).
• Zum Versiegeln zusammendrücken – keine Falten oder Kantenextrusion .
• Perfusion/Gaszufuhr starten; 10–20 Minuten warten, bis sich der Ausgangswert stabilisiert hat.

D. Basiserfassung

• Zeichnen Sie PD und I _sc im Steady State auf (Drift < 1 %/min).
• Messen Sie TER über ΔI oder die AC-Routine und berechnen Sie TEER .

E. Interventionen (Beispiele)

1. Amilorid (apikal) → ↓ I _sc (blockiert ENaC)
2. Forskolin/IBMX (bilateral oder basolateral) → ↑ I _sc (aktiviert CFTR)
3. Bumetanid (basolateral) → ↓ Sekretionsstrom (blockiert NKCC1)
4. Testen Sie Verbindungen apikal/serosal; verfolgen Sie PD/I _sc im Laufe der Zeit; sammeln Sie Proben für den Fluss .

F. Flussprobennahme

• Definieren Sie Intervalle (z. B. alle 10–15 Minuten); halten Sie die Sink-Bedingungen aufrecht (Empfänger < 10 % der Donor-Konzentration).
• Berechnen Sie P _app und Clearance ; normalisieren Sie auf Fläche und Zeit.

G. Abschluss und Qualitätskontrolle

• Überprüfen Sie Offset und Leerwert erneut, um die Stabilität zu bestätigen.
• Temperatur-/pH-Abweichungen protokollieren; Gewebe auf Randschäden untersuchen.

6) Ussing-Kammer-Datenanalyse, Normalisierung und Berichterstattung

Normalisierung

• I _sc in µA/cm²: durch die Blendenfläche dividieren.
• TEER zu Ω·cm²: (R sample − R blank ) × Area
• Geben Sie Mittelwerte ± SEM , n Tiere , n Gewebe/Tier an ; vermeiden Sie Pseudoreplikation.

Typische Grundstücke

• Zeitverlauf von I _sc mit kommentierten Ergänzungen.
• TEER-Trajektorie vor und nach der Behandlung.
• Fluss vs. Zeit; Balkendiagramme von P _app .

Statistiken

• Paaranalyse, wenn dasselbe Gewebe als eigene Kontrolle dient.
• Gemischte Modelle für Designs mit mehreren Tieren und mehreren Geweben.
• Definieren Sie Ausschlusskriterien (Lecks, instabile Basislinien) vorab.

7) Ussing Chamber Troubleshooting (schnelle Diagnose)

8) Experimentelles Design nach Gewebetyp (Ussing-Kammer)

Darm/Kolon

• Erwägen Sie die Gabe von Indomethacin vor der Inkubation, wenn Prostaglandine die Reaktionen beeinträchtigen.
• Sanfte Schleimhautreinigung; Vermeidung von Epitheleinrissen.

Atemwege (Luftröhre/Bronchus)

• ENaC-Blockade mit Amilorid (apikal) ; CFTR-Aktivierung mit Forskolin/IBMX ; Bumetanid-Empfindlichkeit beobachten.

Haut

• Dicker, höherer TEER; sorgt für robuste Abdichtung; ermöglicht längeres Gleichgewicht.

Kultivierte Monoschichten (z. B. Caco-2, primäre Atemwege)

• Überprüfen Sie die Konfluenz-/TEER-Schwellenwerte. Beachten Sie den Widerstand der Filterunterstützung (subtrahieren Sie Leerzeichen). Verwenden Sie Adapterschieber.

9) Checkliste für Qualität und Reproduzierbarkeit

• Kammermodell, Öffnung, Dichtungscharge erfasst
• Temperatur-/pH-Protokolle im Bereich
• Elektrodenversatz vorher/nachher
• Basislinienstabilität (<1 %/min Drift)
• Korrekte Seitenergänzungen und Zeitstempel
• Flächennormalisierung dokumentiert
• Ausschlusskriterien vordefiniert und angewendet
• Rohdateien archiviert (Zeitreihen + Ereignisprotokoll)

10) Sicherheit und Compliance

• Radiotracer: Lizenzierung, Abschirmung, Wischtests, getrennter Abfall.
• Menschliches/tierisches Gewebe: IRB/IACUC-Genehmigungen, entsprechende Biosicherheitsvorkehrungen.
• Chemische Gefahren: Bumetanid, Forskolin, DMSO-Kontrollen; SDS-Zugriff aufrechterhalten.

11) Auswahl und Budgetierung des richtigen Ussing-Kammersystems

Spiel mit Zielen

• Lehr-/Pilotarbeit: Einzelkanal, manuelle Klemme, Basisperfusion.
• Kernlabor/Pharma: Mehrkanal (4–8+), automatisierte Routinen, integrierte Datenerfassung.
• Barriere-Screening: stabile TEER-Messung mit schneller Montage (EasyMount), zuverlässige Perfusions- und Temperaturkontrolle.

Kostenvoranschlag (konfigurationsabhängig)

Die voraussichtlichen Kosten variieren je nach verschiedenen Faktoren (Anzahl der Kanäle und Kammerkonfigurationen). Wir konfigurieren Systeme nach Gewebe, Öffnung und Durchsatz.

12) Ussing Chamber Anhänge

A) Schnellstart-SOP (eine Seite)

1. Warm-/Gaspuffer, eingestellt auf 37 °C.
2. Nullelektroden im symmetrischen Puffer.
3. Gewebe aufziehen (keine Falten, richtige Ausrichtung).
4. Stabilisieren; Basis-PD/I _sc aufzeichnen; TER → TEER messen.
5. Fügen Sie Modulatoren hinzu (Amilorid → Forskolin/IBMX → Bumetanid usw.).
6. Sammeln Sie Flussmittelproben planmäßig und halten Sie die Sinkbedingungen ein.
7. Abschluss: Ausgleiche erneut prüfen, Ausschlüsse dokumentieren.

B) Gemeinsame Berechnungen

• I _sc -Dichte: I sc (µA/cm²) = I raw (µA) / Area (cm²)
• TEER: TEER (Ω·cm²) = (R sample − R blank ) × Area
• P _app : P app = (ΔQ/Δt) / (A × C 0 )
• Leitfähigkeit: G t = 1 / R (bei Bedarf auf Fläche normalisieren)

C) Berichtsvorlage (Kopieren/Einfügen)

• Gewebe: Art/Region; Monolayer-Linie und Passage
• Kammer: Modell, Öffnung (cm²), Dichtungsdicke
• Lösungen: Zusammensetzung, pH-Wert, Temperatur; Gasgemisch
• Klemme: Modell, Abtastrate, TEER-Methode (DC/AC)
• Baseline PD/I _sc /TEER ± SEM (n Tiere, n Gewebe/Tier)
• Agonisten/Antagonisten: Seite, Konzentration, Vehikelkontrolle
• Flussmittel: Tracer, Probenahmeplan, P- _App- Berechnung
• Statistik: Tests, α-Level, Ausschlusskriterien

13) Häufig gestellte Fragen zur Ussing-Kammer