Das Ussing-Kammer-Experiment erklärt: Wie Wissenschaftler den epithelialen Ionentransport messen
Diese Schritt-für-Schritt-Anleitung erklärt das Ussing-Kammer-Experiment – vom Aufbau und der Klemmung bis zur Datenanalyse (I sc , TEER, G t ) – damit Forscher reproduzierbare, für Publikationen geeignete Epitheltransportdaten generieren können.
Kurzzusammenfassung
- Ziel: Quantifizierung des transepithelialen Ionentransports und der Barrierefunktion.
- Am besten geeignet für: Natürliche Epithelien oder Zellmonolagen auf durchlässigen Trägern.
- Kernmesswerte: Kurzschlussstrom (I sc ), transepithelialer Widerstand (TEER), Leitfähigkeit (G t ).
- Kontrollen: Symmetrische Puffer, Resistenz gegen leere Inserts und pharmakologische Blocker.
- Ergebnisse: Mechanistische Einblicke in Kanäle (z. B. CFTR, ENaC), Transporter und die Integrität von Tight Junctions.
Wann verwendet man eine Ussingkammer?
- Um den aktiven transepithelialen Transport zu isolieren (Spannungsklemme bei 0 mV → Messung von I sc ).
- Um die apikalen und basolateralen Effekte von Agonisten/Inhibitoren zu trennen.
- Zur Beurteilung der Barrierequalität mittels TEER und G t .
- Zum Vergleich von Genotypen, Medienbedingungen oder Wirkstoffkandidaten.
Material- und Aufbau-Checkliste
- Ussing-Kammersystem mit Präzisions-Halbzellen und Temperaturregelung (typischerweise 37 °C).
- Spannungs-/Stromzangenverstärker und Datenerfassungssoftware.
- Ag/AgCl-Elektroden mit Salzbrücken; KCl/Agar zur Stabilisierung der Verbindungen.
- Ausgewogene Ringer-Lösung oder gewebespezifische Puffer (pH ≈ 7,4; Gas nach Bedarf).
- Gewebe oder konfluente Monolage auf einem durchlässigen Träger (Dokumentfläche A in cm²).
- Wasserbad oder Inline-Erhitzer; peristaltische oder Schwerkraftperfusion (optional).
- Pharmakologie: Amilorid (ENaC), Forskolin/IBMX (CFTR), Bumetanid (NKCC).
- Kalibriertes pH-Meter, Thermometer und Leitfähigkeits-/Widerstandsmessgerät.
Kernvariablen und typische Bereiche
| Variable | Symbol | Typisches Ziel | Anmerkungen |
|---|---|---|---|
| Badtemperatur | T | 37 °C | Physiologische Anpassung; Temperatur ±0,5 °C einhalten |
| Bad-pH-Wert | — | 7.35–7.45 | CO₂/HCO₃⁻ oder HEPES-gepuffert |
| Kurzschlussstrom | Ich sc | 0,5–200 µA·cm⁻² | Gewebe- und reizabhängig |
| Transepithelialer Widerstand | TEER | 200–2.000 Ω·cm² | Leerzeichen subtrahieren; × Fläche |
| Leitfähigkeit | G t | Niedrig bis mittel | G t = 1/R t ; Leck ↑ → G t ↑ |
Schritt-für-Schritt-Anleitung
- Pufferlösungen vorbereiten – beide Seiten erwärmen/belüften, pH-Wert und Osmolarität angleichen.
- Elektroden kalibrieren – Salzbrücken prüfen, gegebenenfalls nachfüllen.
- Gewebe/Einlage anbringen – Bereich A aufzeichnen, Blasen entlang der Oberfläche entfernen.
- Ausgangslage ausgleichen – 5–10 Minuten vor den Reizen stabilisieren.
- Spannungsklemme – V t =0 mV einstellen; gemessener Strom ist I sc .
- Impuls zur Widerstandsmessung – kleine Spannungsschritte anwenden, um R t zu berechnen.
- Pharmakologie hinzufügen – apikal/basolateral dosieren; Zeitpunkt und Seite dokumentieren.
- Washout & Endpoint – Traces speichern, Ereignisse annotieren, für Statistiken exportieren.
Schlüsselgleichungen (flächennormiert)
R_t (Ω) = ΔV / ΔI TEER (Ω·cm²) = (R_Probe – R_Blindwert) × A G_t (S·cm⁻²) = 1 / TEER I_sc (µA·cm⁻²) = I_gemessen (µA) / A (cm²)
Interpretation der Daten
- ΔI sc nach Agonist → Netto-elektrogener Transport über Zielkanäle.
- Hoher TEER-Wert → intakte Barriere; niedriger TEER-Wert → Leckage oder Beschädigung.
- G t steigt mit zunehmender Permeabilisierung; kombinieren Sie dies mit morphologischen Untersuchungen.
Empfohlene Steuersequenz
- Basislinienklemmung bei 0 mV (I sc ).
- Apikales Amilorid (ENaC-Blockade) → I sc- Abnahme.
- Forskolin/IBMX (stimulieren cAMP) → I sc -Anstieg über CFTR.
- Basolaterales Bumetanid (NKCC-Blockade) → Reduzierung der Triebkraft.
Fehlerbehebung (Schnelle Lösungen)
| Problem | Was Sie sehen | Fix |
|---|---|---|
| Driftende Basislinie | Langsames I sc /V t Kriechen | Salzbrücken wiederherstellen; Temperatur und pH-Wert prüfen; Blasen entfernen. |
| Sehr niedriger TEER-Wert | Hohes G t , verrauschtes Ansprechverhalten | Unversehrtheit des Einlegers prüfen; beschädigtes Gewebe ersetzen; Leerwert abziehen. |
| Keine Reaktion auf den Agonisten | Flache I sc Spur | Reagenzaktivität und -seitliche Wirkung bestätigen; Äquilibrierung verlängern. |
| Spitzenwerte bei der Dosierung | Vorübergehende Artefakte | Langsam zugeben; Osmolarität anpassen; vorsichtig umrühren. |
Profi-Tipp: Geben Sie immer flächennormalisierte Daten (µA·cm⁻², Ω·cm²) an und fügen Sie den um den Leerwert subtrahierten TEER-Wert hinzu – eine häufige Anforderung von Gutachtern.
Häufig gestellte Fragen
Was ist der Unterschied zwischen TEER und I sc ?
TEER spiegelt die Barriereintegrität (parazellulär) wider. I <sub>sc</sub> spiegelt den Nettotransport durch Elektrogenese (transzellulär) unter einer 0-mV-Klemme wider.
Benötige ich eine CO₂-Reduzierung?
Verwenden Sie CO₂/HCO₃⁻-Puffer, wenn Ihr Gewebe diese benötigt; ansonsten ist HEPES für kurze Läufe ausreichend, sofern der pH-Wert stabil ist.
Wie lange sollte ich das Gleichgewicht herstellen?
Üblicherweise 5–10 Minuten nach der Montage; bei dickerem Gewebe länger. Die pharmakologische Behandlung sollte erst nach Erreichen eines stabilen Ausgangswerts begonnen werden.
Checkliste für die Berichterstattung
- Gewebe-/Zellmodell, Passage, Konfluenzkriterien
- Freigelegte Fläche (A), Temperatur, Pufferzusammensetzung
- Klemmeinstellungen, Pulsparameter, Abtastrate
- Blindwiderstand, TEER-Berechnung, Statistik (n, Tests)
- Genaue Reagenziennamen, Konzentrationen und Seitenbindung
Nächster Schritt: Wenn Sie einen optimierten Arbeitsablauf mit hohem Durchsatz benötigen, sollten Sie ein Kammersystem mit schneller Montage und stabiler Temperaturregelung in Betracht ziehen, um die Wiederholgenauigkeit zu verbessern und die Einrichtungszeit zu verkürzen.
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