1) Cosa misura una camera di Ussing e perché

Obiettivo. Quantificare il trasporto transepiteliale e l'integrità della barriera attraverso un tessuto o un monostrato che separa le soluzioni apicali e basolaterali.

Letture elettriche primarie

• PD (differenza di potenziale, mV): tensione a circuito aperto attraverso l'epitelio.

• I _sc (corrente di cortocircuito, µA/cm²): trasporto ionico attivo netto quando PD è fissato a 0 mV.

• TER / TEER (Ω, Ω·cm²): tenuta della barriera; valori più alti = giunzioni più strette.

  • TEER è normalizzato in base all'area : TEER = (R sample − R blank ) × Area

Letture di flusso (chimiche)

• Flusso tracciante paracellulare (ad esempio, mannitolo, FITC-destrano): permeabilità delle giunzioni strette.

• Flusso transcellulare (ad esempio glucosio, amminoacidi): assorbimento mediato dal trasportatore.

• Permeabilità apparente (P _app ) per un soluto: P app = (dQ/dt) / (A × C 0 )

Perché è importante. Questi parametri sono alla base della ricerca sulla fisiologia CFTR/ENaC, sulle malattie infiammatorie intestinali (IBD), sulla celiachia, sui modelli di diarrea, sull'idratazione delle vie aeree, sulla barriera cutanea e sull'assorbimento/tossicità dei farmaci.

2) La fisica: dare un senso a PD, ISC e TEER

• Legge di Ohm (tessuto): V = I × R .

  Quando il voltaggio è limitato a 0 mV, l' I _sc iniettato è uguale al trasporto elettrogenico netto (ad esempio, secrezione di Cl⁻ mediata da CFTR meno assorbimento di Na⁺ da parte di ENaC).

• Le resistenze in serie (soluzione + elettrodi + ponti) si trovano all'esterno del tessuto. Una buona progettazione della camera posiziona gli elettrodi sensibili alla tensione vicino al tessuto per ridurre al minimo la caduta di tensione in serie.

• CA vs CC TEER.

  • Impulso/gradino CC: iniettare brevemente una piccola corrente; calcolare ΔV/ΔI.

  • Impedenza CA: una piccola sinusoide (ad esempio 1 kHz) può isolare la resistenza epiteliale e la capacità se supportata dall'elettronica.

Correzioni da applicare

• Potenziali di giunzione liquida (LJP): abbinare la forza ionica; utilizzare ponti di agar KCl.

• Correzione dell'offset: cortocircuitare gli elettrodi di rilevamento in soluzioni simmetriche; impostare la PD di base ≈ 0 mV prima di montare il tessuto.

• Normalizzazione dell'area: riportare sempre µA/cm² (I _sc ) e Ω·cm² (TEER) utilizzando la vera area di apertura .

3) Hardware della camera di Ussing: cosa fa ogni componente

Camere e cursori (aperture)

• Classiche metà divise: massima flessibilità; è richiesta maggiore abilità nella manipolazione.
• EasyMount : montaggio guidato, rapido e ripetibile; riduce i danni ai tessuti e la variabilità.
• L'apertura determina la sensibilità e la normalizzazione (comune: 0,071–0,64 cm²).
• Le guarnizioni (spessore, cedevolezza) controllano la compressione; un serraggio eccessivo provoca perdite dai bordi o ischemia.

Elettrodi e ponti

• Elettrodi Ag/AgCl tramite ponti agar-KCl (ad esempio, 3 M KCl in agar al 2-3%).
• Tenere gli elettrodi di rilevamento vicini al tessuto; gli elettrodi di corrente più lontani.
• Manutenzione: riclorare periodicamente i fili di Ag; sostituire i ponti torbidi o disidratati.

Perfusione, Gas, Temperatura

• Gas lift con 95% O₂ / 5% CO₂ (carbogen) per tamponi di bicarbonato; la delicata formazione di bolle riduce gli strati non mescolati.
• La perfusione (costante o a intervalli) previene l'esaurimento/accumulo; mantiene le concentrazioni stabilite del farmaco.
• Temperatura : 37 °C con riscaldatori in blocco o in linea e sonde calibrate; variazioni di deriva anche di 1–2 °C I _sc /TEER.

Morsetti e DAQ

• Le pinze tensione-corrente (mono/multicanale) misurano le scariche parziali (PD), iniettano corrente e calcolano automaticamente I _sc /TEER.
• Acquisizione dati : eventi con timestamp, passaggi del protocollo e annotazioni migliorano la riproducibilità.

Cerchi sistemi? Vedi Sistemi della Camera di Ussing e Protocollo della Camera di Ussing .

4) Soluzioni e ricette per la camera di Ussing (esempi pratici)

Verificare con il proprio IACUC/IRB/SOP. La chimica del tampone influenza le LJP, le forze motrici del trasporto e la vitalità.

Bicarbonato di Krebs-Ringer (tipico)

• NaCl 117 mM, KCl 4,7 mM, CaCl₂ 2,5 mM, MgSO₄ 1,2 mM, KH₂PO₄ 1,2 mM, NaHCO₃ 25 mM, Glucosio 10 mM
• Gas con 95% O₂ / 5% CO₂, 37 °C

Coppia osmotica mannitolo/glucosio (osmolalità simmetrica)

• Sierosale: glucosio 10 mM; apicale: mannitolo 10 mM (o viceversa) per isolare le asimmetrie di trasporto.

Modulatori comuni

• Amiloride (apicale) → Blocco ENaC (↓ assorbimento di Na⁺)
• Forskolin/IBMX → ↑ cAMP → ↑ secrezione di Cl⁻ mediata da CFTR
• Bumetanide (basolaterale) → blocco NKCC1 (limita il carico di Cl⁻ → ↓ secrezione)
• CFTR inh -172 → inibisce le correnti CFTR

Esempi di traccianti per il flusso

• Paracellulare: mannitolo, FITC-destrano (3–4 kDa)
• Transcellulare: glucosio radiomarcato, aminoacidi (rispettare i protocolli di sicurezza)

5) Protocollo della camera di Ussing: procedura operativa standard passo dopo passo (testata sul campo)

A. Controlli pre-corsa (10–20 min)

1. Offset dell'elettrodo: immergere entrambe le punte di rilevamento nello stesso tampone; regolare PD ≈ 0 mV.
2. Salute del ponte: aspirazione delicata → flusso libero; nessuna bolla.
3. Temperatura: stabilizzare le camere a 37 °C (±0,2 °C).
4. Soluzioni: preriscaldare e gasare; verificare il pH (7,3–7,4) e l'osmolalità (±5 mOsm).
5. TER vuoto: assemblare con una guarnizione/senza tessuto se la SOP richiede R _vuoto .

B. Preparazione del tessuto/inserto

• Tessuto nativo: sezionare con attenzione; aprire lungo il bordo mesenterico; tagliare fino all'apertura.
• Monostrati (ad esempio, Transwell): risciacquare, equilibrare per 15–30 minuti; utilizzare cursori adattatori se necessario.

C. Montaggio (2–5 min con EasyMount)

• Allineare i tessuti (mucosa → apicale, sierosa → basolaterale).
• Comprimere per sigillare, senza pieghe o estrusione dei bordi .
• Avviare la perfusione/gas; attendere 10-20 minuti per la stabilizzazione della linea di base.

D. Acquisizione di base

• Registrare PD, I _sc allo stato stazionario (deriva < 1%/min).
• Misurare TER tramite routine ΔI o AC; calcolare TEER .

E. Interventi (esempi)

1. Amiloride (apicale) → ↓ I _sc (blocca ENaC)
2. Forskolin/IBMX (bilaterale o basolaterale) → ↑ I _sc (attiva CFTR)
3. Bumetanide (basolaterale) → ↓ corrente secretoria (blocca NKCC1)
4. Testare i composti apicali/sierosi; monitorare PD/I _sc nel tempo; raccogliere campioni per il flusso .

F. Campionamento del flusso

• Definire gli intervalli (ad esempio, ogni 10-15 minuti); mantenere le condizioni di sink (ricevitore < 10% della concentrazione del donatore).
• Calcola P _app e clearance ; normalizza all'area e al tempo.

G. Chiusura e controllo qualità

• Ricontrollare l'offset e il blank per confermare la stabilità.
• Registrare le deviazioni di temperatura/pH; ispezionare il tessuto per verificare la presenza di danni ai bordi.

6) Analisi dei dati, normalizzazione e reporting della Camera di Ussing

Normalizzazione

• Da _{1 sc} a µA/cm²: dividere per l'area di apertura.
• TEER a Ω·cm²: (R sample − R blank ) × Area
• Il rapporto indica ± SEM , n animali , n tessuti/animale ; evitare la pseudo-replicazione.

Trame tipiche

• Andamento temporale della I _sc con aggiunte annotate.
• Traiettoria TEER pre e post trattamento.
• Flusso vs tempo; grafici a barre _dell'app P.

Statistiche

• Analisi accoppiata quando lo stesso tessuto funge da controllo di se stesso.
• Modelli misti per progetti multi-animale e multi-tessuto.
• Predefinire i criteri di esclusione (perdite, valori di base instabili).

7) Risoluzione dei problemi della camera di Ussing (diagnostica rapida)

8) Progettazione sperimentale per tipo di tessuto (camera di Ussing)

Intestino/Colon

• Se le prostaglandine confondono le risposte, prendere in considerazione la preincubazione con indometacina .
• Pulizia delicata della mucosa; evitare lacerazioni epiteliali.

Vie aeree (trachea/bronchi)

• Blocco ENaC con amiloride (apicale) ; attivazione CFTR con forskolina/IBMX ; osservare la sensibilità al bumetanide.

Pelle

• TEER più spesso e più elevato; garantisce una tenuta robusta; consente un bilanciamento più lungo.

Monostrati coltivati (ad esempio, Caco-2, vie aeree primarie)

• Verificare le soglie di confluenza/TEER; considerare la resistenza del supporto del filtro (sottraendo lo spazio vuoto); utilizzare i cursori dell'adattatore.

9) Lista di controllo della qualità e riproducibilità

• Modello della camera, apertura, lotto di guarnizioni registrato
• Registri di temperatura/pH entro l'intervallo
• Offset dell'elettrodo prima/dopo
• Stabilità di base (deriva <1%/min)
• Aggiunte laterali corrette e timestamp
• Normalizzazione dell'area documentata
• Criteri di esclusione predefiniti e applicati
• File grezzi archiviati (serie temporali + registro eventi)

10) Sicurezza e conformità

• Radiotraccianti: licenze, schermatura, test di pulizia, rifiuti separati.
• Tessuti umani/animali: approvazioni IRB/IACUC, appropriate precauzioni di biosicurezza.
• Pericoli chimici: controlli su bumetanide, forskolina, DMSO; mantenere l'accesso alla SDS.

11) Selezione e budget del giusto sistema della Camera di Commercio di Ussing

Partita per obiettivi

• Insegnamento/lavoro pilota: canale singolo, pinza manuale, perfusione di base.
• Laboratorio principale/farmaceutica: multicanale (4–8+), routine automatizzate, DAQ integrato.
• Screening di barriera: misurazione TEER stabile con montaggio rapido (EasyMount), controllo affidabile della perfusione e della temperatura.

Aspettative di costo (dipendenti dalla configurazione)

I costi previsti variano in base a diversi fattori (numero di canali e configurazione delle camere). Configuriamo i sistemi in base al tessuto, all'apertura e alla produttività.

12) Appendici della Camera di Ussing

A) Procedura operativa standard rapida (una pagina)

1. Tamponi caldi/gas; impostare 37 °C.
2. Elettrodi zero nel buffer simmetrico.
3. Montare il tessuto (senza pieghe, orientamento corretto).
4. Stabilizzare; registrare il PD/I basale _sc ; misurare TER → TEER.
5. Aggiungere modulatori (amiloride → forskolina/IBMX → bumetanide, ecc.).
6. Raccogliere i campioni di flusso nei tempi previsti; mantenere le condizioni di dissipazione.
7. Chiusura: ricontrollare gli offset; escludere i documenti.

B) Calcoli comuni

• Densità I _sc : I sc (µA/cm²) = I raw (µA) / Area (cm²)
• TEER: TEER (Ω·cm²) = (R sample − R blank ) × Area
• P _app : P app = (ΔQ/Δt) / (A × C 0 )
• Conduttanza: G t = 1 / R (normalizzare all'area se necessario)

C) Modello di segnalazione (copia/incolla)

• Tessuto: specie/regione; linea monostrato e passaggio
• Camera: modello, apertura (cm²), spessore della guarnizione
• Soluzioni: composizioni, pH, temperatura; miscela di gas
• Clamp: modello, frequenza di campionamento, metodo TEER (CC/CA)
• PD/I _sc /TEER basale ± SEM (n animali, n tessuti/animale)
• Agonisti/antagonisti: lato, concentrazione, controllo del veicolo
• Flusso: tracciante, programma di campionamento, calcolo _dell'app P
• Statistica: test, livello α, criteri di esclusione

13) Domande frequenti sulla Camera di Ussing