非甾体抗炎药格拉芬宁通过抑制花生四烯酸通路中的环氧合酶-2挽救Ⅱ类 CFTR 突变体
大多数囊性纤维化（CF）病例是由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的Ⅱ类突变引起的。这些蛋白仍保留部分通道功能，但被滞留在内质网（ER）中。通过开发可直接与 CFTR 结合的药理伴侣分子（Tezacaftor 和 Elexacaftor），已在一定程度上挽救了最常见的Ⅱ类 CFTR 突变体 F508del-CFTR。然而，目前尚不清楚这些药物是否能够将所有Ⅱ类 CFTR 突变体挽救至具有临床意义的水平。我们此前已证明，非甾体抗炎药（NSAID）布洛芬可以纠正 F508del-CFTR 的转运缺陷。在本研究中，我们利用 RNAi 和药理学抑制剂来阐明 NSAID 格拉芬宁的作用机制。通过细胞热稳定性分析（CETSA），我们表明其是一种蛋白稳态调节剂。借助药物化学方法，我们鉴定出一种衍生物，其 CFTR 校正活性提高了四倍。此外，我们还发现，这些新型花生四烯酸通路抑制剂能够挽救一些难以校正的Ⅱ类突变体，例如在高度分化的人支气管上皮（HBE）细胞中，G85E-CFTR 的功能可恢复至非 CF 细胞的 13% 以上。因此，这些结果表明，靶向花生四烯酸通路可能是一种开发此前难以校正的某些Ⅱ类 CFTR 突变校正剂的有效途径。
原代人支气管上皮（HBE）细胞的电压钳研究
HBE 细胞接种于包被纤维连接蛋白的 Snapwell 插入膜（Corning，美国马萨诸塞州 Tewksbury），并在 24 小时后去除顶端培养基以建立气–液界面。采用 EVOM 上皮伏欧计 监测跨上皮电阻；当培养 4 周、跨上皮电阻达到 300–400 Ω·cm² 时使用单层细胞。表达 F508del-CFTR 的 HBE 单层细胞在双侧分别处理 0.1% 二甲基亚砜（阴性对照）或 10 μM 测试化合物（VX-809 除外，其浓度为 1 μM），处理液为含 2%（v/v）胎牛血清的 OptiMEM。将单层细胞装载于改良的 Ussing 腔中，使用 VCCMC6 多通道电流-电压钳（Physiologic Instruments，Venice FL）进行电压钳记录，测量短路电流（Isc）。
通过用 200 μg/ml 制霉菌素透化基底外侧膜，并施加顶端至基底外侧的 Cl⁻ 浓度梯度，从而在功能上分离顶端膜电导。基底外侧溶液成分为：1.2 mM NaCl、115 mM Na-葡萄糖酸盐、25 mM NaHCO₃、1.2 mM MgCl₂、4 mM CaCl₂、2.4 mM KH₂PO₄、1.24 mM K₂HPO₄ 和 10 mM 葡萄糖（pH 7.4）。顶端溶液成分为：115 mM NaCl、25 mM NaHCO₃、1.2 mM MgCl₂、1.2 mM CaCl₂、2.4 mM KH₂PO₄、1.24 mM K₂HPO₄ 和 10 mM 甘露醇（pH 7.4）。用甘露醇替代顶端溶液中的葡萄糖，以消除由 Na⁺-葡萄糖协同转运介导的电流。在上述条件下，基底外侧膜成功透化可通过 Isc 的反转清楚地观察到。所有溶液均维持在 37 °C，并通过通入 95% O₂/5% CO₂ 持续搅拌。跨上皮电压通过琼脂盐桥 Ag/AgCl 电极测量。每 90 秒施加一次脉冲（幅度 1 mV，持续 1 s）以监测电阻，并使用 PowerLab/8SP 接口进行数据采集。通过向顶端浴液中加入 10 µM 福斯可林 + 50 µM 金雀异黄素来激活 CFTR，所产生的 Isc 对 CFTR 抑制剂 inh-172（10 µM）敏感，从而证实该电流由 CFTR 介导。