¿Qué son las pinzas de tensión?
La abrazadera de voltaje
Wiki Definido por abrazadera de voltaje
Los electrofisiólogos utilizan la pinza de voltaje para medir las corrientes iónicas a través de una membrana neuronal mientras se mantiene el voltaje de la membrana en un nivel establecido. Las membranas neuronales contienen muchos tipos diferentes de canales iónicos, algunos de los cuales están regulados por voltaje. La abrazadera de voltaje permite manipular el voltaje de la membrana independientemente de las corrientes iónicas, lo que permite estudiar las relaciones corriente-voltaje de los canales de la membrana.[1]
El concepto de pinza de tensión se debe a Kenneth Cole[2] y George Marmount[3] en la década de 1940. Cole descubrió que era posible utilizar dos electrodos y un circuito de retroalimentación para mantener el potencial de membrana de la célula en un nivel establecido por el experimentador.
Alan Hodgkin se dio cuenta de que, para comprender el flujo de iones a través de la membrana, era necesario eliminar las diferencias en el potencial de membrana.[4] Después de experimentos con la pinza de voltaje, Hodgkin y Andrew Huxley esbozaron las causas iónicas del potencial de acción en 1952, por lo que compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1963.
Técnica
La pinza de tensión es un generador de corriente con dos electrodos. El voltaje transmembrana se registra a través de un "electrodo de voltaje", con respecto a tierra, y un "electrodo de corriente" pasa corriente a la celda. El experimentador establece un "voltaje de mantenimiento" o "potencial de comando", y la pinza de voltaje utiliza retroalimentación negativa para mantener la celda en este voltaje. Los electrodos están conectados a un amplificador, que mide el potencial de membrana y envía la señal a un amplificador de retroalimentación. Este amplificador también recibe una entrada del generador de señal que determina el potencial de comando, resta el potencial de membrana del potencial de comando (Vcomando - Vm), magnifica cualquier diferencia y envía una salida al electrodo de corriente. Siempre que la celda se desvía del voltaje de mantenimiento, el amplificador operacional genera una "señal de error", es decir, la diferencia entre el potencial de comando y el voltaje real de la celda. El circuito de retroalimentación pasa corriente a la celda para reducir la señal de error a cero. Así, el circuito de pinza produce una corriente igual y opuesta a la corriente iónica. Esto se puede medir, dando una reproducción precisa de las corrientes que fluyen a través de la membrana.
Cole desarrolló la técnica de fijación de voltaje antes de la era de los microelectrodos, por lo que sus dos electrodos consistían en finos cables trenzados alrededor de una varilla aislante. Debido a que este tipo de electrodo sólo podía insertarse en las células más grandes, los primeros experimentos electrofisiológicos se realizaron casi exclusivamente en axones de calamar. Los calamares lanzan chorros de agua cuando necesitan moverse rápidamente, como cuando escapan de un depredador. Para que este escape sea lo más rápido posible, cuentan con un axón que puede alcanzar 1 mm de diámetro (las señales se propagan más rápidamente por axones grandes). El axón gigante del calamar fue la primera preparación que pudo usarse para bloquear una corriente transmembrana y fue la base de los experimentos pioneros de Hodgkin y Huxley sobre las propiedades del potencial de acción.
Variaciones de la técnica de fijación de voltaje.
Puede encontrar una discusión más detallada de las siguientes técnicas en la Guía Axon. El libro ya está agotado, pero se puede descargar en formato PDF desde Axon Instruments.
Voltaje de dos electrodos
el axón del calamar de manera uniforme en toda su longitud. Los microelectrodos pueden proporcionar sólo una fuente puntual espacial de corriente que podría no afectar de manera uniforme a diferentes partes de una celda de forma irregular.
Pinza de voltaje de un solo electrodo
En esto, se coloca un electrodo dentro de una celda y cumple con las funciones de registro de voltaje y paso de corriente.
Pinza continua monoelectrodo (SEVC-c)
Artículo principal: abrazadera de parche
La técnica "patch-clamp" permite el estudio de canales iónicos individuales. Utiliza un electrodo con una punta relativamente grande (> 1 micrómetro) que tiene una superficie lisa (en lugar de una punta afilada). Se trata de un "electrodo de parche" (a diferencia del "electrodo afilado" que se utiliza para empalar células). Este electrodo se presiona contra una membrana celular y se aplica succión para tirar de la membrana celular hacia el interior de la punta del electrodo. La succión hace que la celda forme un sello hermético con el electrodo (un "sello de gigaohmios", ya que la resistencia es superior a un gigaohmios).
SEV-c tiene la ventaja de que puede grabar desde células pequeñas que serían imposibles de atravesar con dos electrodos. Sin embargo:
1) Los microelectrodos son conductores imperfectos; generalmente tienen una resistencia de más de un millón de ohmios. Rectifican (es decir, cambian su resistencia con el voltaje, a menudo de manera irregular), a veces tienen una resistencia inestable si se obstruyen por el contenido de la celda. Por lo tanto, no registrarán fielmente el voltaje de la celda, especialmente cuando cambia rápidamente, ni transmitirán corriente fielmente.
2) Errores de voltaje y corriente: el circuito SEV-c en realidad no mide el voltaje de la celda que se está sujetando (como lo hace una abrazadera de dos electrodos). El amplificador de abrazadera de conexión es como una abrazadera de dos electrodos, excepto que los circuitos de medición de voltaje y de paso de corriente están conectados (en la abrazadera de dos electrodos, están conectados a través de la celda). El electrodo está conectado a un cable que hace contacto con el bucle de corriente/voltaje dentro del amplificador. Por tanto, el electrodo sólo tiene una influencia indirecta sobre el circuito de realimentación. El amplificador lee solo el voltaje en la parte superior del electrodo y devuelve corriente para compensar. Pero, si el electrodo es un conductor imperfecto, el circuito de abrazadera sólo tiene una visión distorsionada del potencial de membrana. De manera similar, cuando el circuito devuelve corriente para compensar ese voltaje (distorsionado), el electrodo distorsionará la corriente antes de que llegue a la celda. Para compensar esto, el electrofisiólogo utiliza el electrodo de menor resistencia posible, se asegura de que las características del electrodo no cambien durante un experimento (por lo que los errores serán constantes) y evita registrar corrientes con una cinética que probablemente sea demasiado rápida para la pinza. seguir con precisión. La precisión de SEV-c aumenta cuanto más lentos y pequeños son los cambios de voltaje que intenta frenar.
3) Errores de resistencia en serie: Las corrientes que pasan a la celda deben ir a tierra para completar el circuito. El amplificador registra los voltajes en relación con tierra. Cuando una célula se mantiene en su potencial de reposo natural, no hay problema; la pinza no pasa corriente y el voltaje lo genera únicamente la celda. Pero cuando se fija a un potencial diferente, los errores de resistencia en serie se convierten en una preocupación; la célula pasará corriente a través de su membrana en un intento de volver a su potencial de reposo natural. El amplificador de pinza se opone a esto pasando corriente para mantener el potencial de retención. Surge un problema porque el electrodo está entre el amplificador y la celda, es decir, el electrodo está en serie con la resistencia que es la membrana de la celda. Por lo tanto, al pasar corriente a través del electrodo y la celda, la Ley de Ohm nos dice que esto causará que se forme un voltaje a través de la resistencia de la celda y del electrodo. Como estas resistencias están en serie, las caídas de voltaje se sumarán. Si el electrodo y la membrana celular tienen resistencias iguales (lo que generalmente no es así), y si el experimentador ordena un cambio de 40 mV desde el potencial de reposo, el amplificador pasará suficiente corriente hasta que lea que ha logrado ese cambio de 40 mV. Sin embargo, en este ejemplo, la mitad de esa caída de voltaje ocurre a través del electrodo. El experimentador cree que ha movido el voltaje de la celda en 40 mV, pero solo lo ha movido en 20 mV. La diferencia es el "error de resistencia en serie". Los amplificadores de abrazadera de conexión modernos tienen circuitos para compensar este error, pero compensan sólo el 70-80% del mismo. El electrofisiólogo puede reducir aún más el error registrando en o cerca del potencial de reposo natural de la célula y utilizando un electrodo de resistencia lo más baja posible.
4) Errores de capacitancia. Los microelectrodos son condensadores y son particularmente problemáticos porque no son lineales. La capacitancia surge porque el electrolito dentro del electrodo está separado por un aislante (vidrio) de la solución exterior. Este es, por definición y función, un condensador. Peor aún, a medida que el grosor del vidrio cambia cuanto más se aleja de la punta, la constante de tiempo del condensador variará. Esto produce un registro distorsionado del voltaje o la corriente de la membrana cada vez que cambian. Los amplificadores pueden compensar esto, pero no del todo porque la capacitancia tiene muchas constantes de tiempo. El experimentador puede reducir el problema manteniendo la solución de baño de la celda a poca profundidad (exponiendo menos superficie de vidrio al líquido) y recubriendo el electrodo con silicona, resina, pintura u otra sustancia que aumente la distancia entre las soluciones interior y exterior.
5) Errores de sujeción espacial. Un solo electrodo es una fuente puntual de corriente. En partes distantes de la celda, la corriente que pasa a través del electrodo tendrá menos influencia que en partes cercanas de la celda. Esto es particularmente un problema cuando se graban desde neuronas con estructuras dendríticas elaboradas. No se puede hacer nada con respecto a los errores de fijación espacial excepto moderar las conclusiones del experimento.
Pinza de tensión discontinua de un solo electrodo
Una pinza de voltaje de un solo electrodo, discontinua o SEVC-d, tiene algunas ventajas sobre SEVC-c para el registro de “celda completa”. En esto, se adopta un enfoque diferente para pasar corriente y registrar voltaje. Un amplificador SEVC-d oscila entre la corriente de paso y la tensión de medición. Una oscilación es un "ciclo de trabajo". Durante un ciclo, el amplificador mide el potencial de membrana y lo compara con el potencial de retención. Un amplificador operacional mide la diferencia y genera una señal de error. Esta corriente es una imagen especular de la corriente generada por la celda. Las salidas del amplificador cuentan con circuitos de muestreo y retención, por lo que cada voltaje muestreado brevemente se mantiene en la salida hasta la siguiente medición en el siguiente ciclo. Específicamente, el amplificador mide el voltaje en los primeros milisegundos del ciclo, genera la señal de error y pasa el resto del ciclo pasando corriente para reducir ese error. Al comienzo del siguiente ciclo, se mide nuevamente el voltaje, se genera una nueva señal de error, pasa corriente, etc. El experimentador establece la duración del ciclo y es posible tomar muestras cada 500-333 microsegundos.
Para que esto funcione, la capacitancia de la celda debe ser mayor que la capacitancia del electrodo en al menos un orden de magnitud. La capacitancia ralentiza la cinética (los tiempos de subida y bajada) de las corrientes. Si la capacitancia del electrodo es mucho menor que la de la celda, cuando la corriente pasa a través del electrodo, el voltaje del electrodo cambiará más rápido que el voltaje de la celda. Por lo tanto, cuando inyecta corriente y luego la apaga (al final de un ciclo de trabajo), el voltaje del electrodo disminuirá más rápido que el voltaje de la celda. Tan pronto como el voltaje del electrodo es asíntoto al voltaje de la celda, se puede muestrear el voltaje (nuevamente) y aplicar el siguiente bolo de corriente. Por lo tanto, la frecuencia del ciclo de trabajo se limita a la velocidad a la que el voltaje del electrodo aumenta y disminuye mientras pasa la corriente. Cuanto menor sea la capacitancia del electrodo, más rápido se podrá realizar el ciclo.
SEVC-d tiene una gran ventaja sobre SEVC-c al permitir al experimentador medir el potencial de membrana y, como evita el paso de corriente y la medición de voltaje al mismo tiempo, nunca hay un error de resistencia en serie. Las principales desventajas son que la resolución temporal es limitada y el amplificador es inestable. Si pasa demasiada corriente, de modo que se sobrepasa el voltaje objetivo, invierte la polaridad de la corriente en el siguiente ciclo de trabajo. Esto hace que no alcance el voltaje objetivo, por lo que el siguiente ciclo invierte nuevamente la polaridad de la corriente inyectada. Este error puede crecer con cada ciclo hasta que el amplificador oscile fuera de control (“timbre”); Esto suele provocar la destrucción de la célula que se está grabando. El investigador quiere un ciclo de trabajo corto para mejorar la resolución temporal; El amplificador tiene compensadores ajustables que harán que el voltaje del electrodo decaiga más rápido, pero si se ajustan demasiado alto, el amplificador sonará, por lo que el investigador siempre está tratando de "sintonizar" el amplificador lo más cerca posible del borde de la oscilación incontrolada, en en cuyo caso pequeños cambios en las condiciones de grabación pueden provocar un timbre. Hay dos soluciones: “retroceder” la configuración del amplificador a un rango seguro o estar alerta a las señales de que el amplificador está a punto de sonar.
Referencias
- Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM [2000] Principios de la ciencia neuronal, 4ª ed. págs.152-153. McGraw-Hill, Nueva York
- Oso, Mark F.; Connors, Barry W.; Paradiso, Michael A. [1996] (15 de febrero de 2006). "Capítulo 4: El potencial de acción", Neurociencia: exploración del cerebro, tercera edición, Filadelfia, Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins, 84. ISBN 0-7817-6003-8, LCC QP355.2.B42.
- Una breve historia de la neurociencia computacional Universidad de Duke. Recuperado el 23 de enero de 2007.
- ab Huxley A (2002) Del sobreimpulso a la fijación de voltaje Tendencias en neurociencias 25:553-558
Obtenido de "http://en.wikipedia.org/wiki/Voltage_clamp"