La “pequeña cámara” de Ussing: más de 60 años y contando
La “pequeña cámara” de Ussing: más de 60 años y contando
Kirk Hamilton
Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Médicas de Otago, Universidad de Otago, Dunedin, Nueva Zelanda
Un comentario sobre
Transporte activo de sodio como fuente de corriente eléctrica en la piel de rana aislada en cortocircuito.
por Ussing, HH y Zerahn, R. (1951). Acta Physiol. Escanear. 23, 110-127.
Generalmente, un comentario sobre las fronteras de la fisiología está dirigido a un artículo de investigación reciente que tiene el potencial de tener un impacto importante en un campo de investigación científica en particular. Sin embargo, ¿dónde estaría el campo de la fisiología del transporte de iones epiteliales sin la cámara de Ussing? Hay que plantearse esa pregunta en el centenario del nacimiento del gran fisiólogo danés Hans Henriksen Ussing y su famosa “pequeña cámara”; que ya tiene más de 60 años.
Los monumentales trabajos de Ussing (1911-2000), que comenzaron hace casi 65 años, marcaron el comienzo de la “era de la fisiología del transporte de iones epiteliales”, que todavía florece hoy en numerosos laboratorios de fisiología epitelial en todo el mundo. De hecho, Lindemann (2001) resumió la contribución de Ussing a la ciencia en cuatro simples palabras: "...fundador del transporte epitelial..." Palmer y Andersen (2008) rindieron homenaje a Ussing escribiendo "... En cierto sentido, el campo de la polaridad epitelial comenzó en 1958 con el artículo de Koefoed-Johnsen y Ussing".
El objetivo de este comentario es resaltar el artículo clásico de Hans Ussing en el que utilizó su ahora famosa “Cámara pequeña” y la implementación de la incipiente técnica de corriente de cortocircuito para definir el transporte activo de sodio como fuente de corriente eléctrica a través de la piel de rana aislada (Ussing y Zerahn, 1951). Este único artículo introdujo una nueva dirección de investigación que nos ha permitido comprender muchos modelos celulares de fisiología del transporte de iones en numerosos tejidos epiteliales del cuerpo. En particular, para apreciar rápidamente el impacto del trabajo de Ussing, si se escribe “Ussing” en PubMed, se identifican más de 2.975 citas en el momento de escribir este manuscrito. Sin duda hay cientos, si no miles; de otros trabajos de investigación en los que se ha utilizado la técnica de la cámara de Ussing pero no se ha capturado en los índices de búsqueda científica. Se remite al lector a revisiones recientes sobre la perspectiva histórica de Ussing y los detalles técnicos de la técnica de cortocircuito de la cámara de Ussing realizadas por Larsen (2002), Palmer y Andersen (2008) y Clarke (2009).
Antes del artículo de 1951, Ussing había establecido que el flujo de entrada de Na+ a través de la piel de la rana era mayor que el flujo de salida de Na+ usando doble marcaje con Na24 y Na22, respectivamente (Levi y Ussing, 1949). La introducción de Ussing de su cámara Ussing (Ussing y Zerahn, 1951) y la implementación de la técnica de corriente de cortocircuito en la que montó un epitelio aislado de piel de rana entre dos cámaras llenas de líquido (Figura 1, esencialmente el mismo diseño que se usa hoy en día; http ://www.ussingchamber.com/) fue el comienzo de una nueva era de investigación. Esto permitió la primera investigación de la fisiología del transporte de iones (Na+, en este caso) de un epitelio. El montaje del epitelio de piel de rana entre las cámaras llenas de líquido permitió el acceso físico a ambos lados de la capa epitelial para probar los moduladores del transporte de iones. De hecho, Ussing y Zerahn utilizaron cobre, adrenalina y un “extracto neurohipofisario” para examinar la modulación del transporte de Na24 y la corriente de cortocircuito de la piel de rana. Ussing y Zerahn, utilizando la técnica del cortocircuito, pudieron cortocircuitar los tejidos llevando (fijación de voltaje) cualquier corriente transepitelial generada a cero. Esta corriente era indicativa de transporte activo determinado por los procesos de transporte neto. Finalmente, Ussing y Zerahn demostraron que la corriente de cortocircuito de la piel de la rana estaba determinada esencialmente por el transporte activo de Na+ a través del epitelio de la piel de la rana.
FIGURA 1
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Figura 1. Diagrama del aparato de la cámara de Ussing. Las abreviaturas son: A y A′ son electrodos sensores de voltaje; a son las líneas de aire para airear la piel de rana; B y B' son electrodos de paso de corriente; C son las dos medias cámaras; S es donde se inserta la piel entre las medias cámaras; D es la batería y W el divisor de potencial que se utiliza para ajustar (mediante corriente) el voltaje a través de la piel para que sea igual a cero (es decir, en cortocircuito) medido por P el potenciómetro (voltímetro); cualquier corriente que pase por la piel mientras la piel está en cortocircuito se mide con el microamperímetro M y es la corriente en cortocircuito (μA), por lo tanto, transporte activo. La reproducción de la Figura 1 de Ussing y Zerahn (1951) se realiza con la amable autorización de John Wiley and Sons.
Hay cinco avances importantes del artículo de Ussing y Zerahn (1951). Primero, Ussing y Zerahn aplicaron la técnica del cortocircuito a una preparación de tejido epitelial. En segundo lugar, describen el aparato (la cámara de Ussing) que les permitió determinar la medición simultánea del transporte de Na+ y de la corriente eléctrica a través de la piel de la rana. En tercer lugar, Ussing y Zerahn bañaron la piel de la rana con soluciones idénticas (solución de Ringer con alto contenido de NaCl), por lo que no habría flujo pasivo de iones. Por lo tanto, los iones que se mueven mediante transporte activo continuarán y la corriente de cortocircuito observada resultará de un transporte neto de esos iones. En cuarto lugar, Ussing y Zerahn desarrollaron una hipótesis en la que es posible calcular la fuerza electromotriz del Na+ y también la resistencia a la corriente de Na+ procedente de la salida de Na+ y de la corriente de cortocircuito. Finalmente, informaron que la corriente de cortocircuito de la piel de rana era esencialmente el transporte activo neto de Na+ basándose en los experimentos con Na24 en comparación con las mediciones de corriente de cortocircuito. En otras palabras, el influjo de Na+ a través de todo el epitelio de la piel de la rana (desde el agua del estanque hasta la sangre) dominó el flujo de salida de Na+ y se transportó muy poco Na+ desde la sangre al agua del estanque.
Implicaciones del artículo de 1951
La descripción inicial de que el Na+ era la base eléctrica de la corriente de cortocircuito llevó a Ussing a proponer el modelo celular para la absorción de Na+ a través del epitelio de la piel de rana, que fue el tema de su artículo clásico de 1958 (Koefoed-Johnsen y Ussing, 1958). Recientemente, Palmer y Andersen (2008) revisaron elocuentemente el artículo de 1958.
Brevemente, la característica esencial del modelo celular de Ussing sobre la absorción de Na+ por los epitelios es que la célula epitelial (una caja negra) se considera dos membranas dispuestas en serie separadas por un compartimento intracelular. La anatomía de las células epiteliales es muy diferente a la de las células musculares o nerviosas. Ahora sabemos que las células epiteliales están polarizadas, en el sentido de que las proteínas de transporte que residen en la membrana apical son bastante diferentes de las de la membrana basolateral. Estas proteínas de transporte funcionan, en conjunto, para realizar una tarea de transporte específica, como la reabsorción de Na+ por la célula del conducto colector de la nefrona, por ejemplo. El trabajo inicial de Ussing con la piel de rana ha llevado a más de dos generaciones de científicos a comprender este concepto de células "polarizadas". Ussing y Koefoed-Johnsen predijeron que el Na+ se movía pasivamente a través de “la superficie exterior” (membrana apical) de la piel de la rana; sin embargo, ese transporte era altamente selectivo. Por lo tanto, el Na+ ingresa a la célula siguiendo su gradiente de concentración. Sugirieron que el transporte activo de Na+ se localizaba en la “membrana que mira hacia adentro” (basolateral) de la célula epitelial. Además, Koefoed-Johnsen y Ussing escribieron que se producía un “…intercambio forzado de Na+ contra K+…” (es decir, Na+/K+-ATPasa) a través de la membrana basolateral y había una vía para que el K+ saliera de la célula a través de la membrana basolateral. Curiosamente, Ussing (1947) había sugerido previamente que el Na+ se movía en contra de su propio gradiente de concentración y de un potencial eléctrico. La Na+/K+-ATPasa mantiene la baja concentración celular de Na+ y la alta concentración extracelular de Na+ para ayudar a mantener la fuerza impulsora para la entrada de Na+ a través de la membrana apical (membrana externa de la piel de rana).
El modelo celular de absorción epitelial de Na+ de Koefoed-Johnsen y Ussing se ha confirmado y ampliado repetidamente en numerosos tejidos epiteliales a lo largo de los años. Los tejidos examinados incluyen vejiga urinaria de anfibios y mamíferos, colon distal, varios segmentos de la nefrona distal de mamíferos, epitelios respiratorios, conductos sudoríparos y numerosas líneas celulares cultivadas derivadas de varios tejidos epiteliales de absorción estrecha.
En última instancia, la sugerencia de Ussing (Koefoed-Johnsen y Ussing, 1958) de “…el movimiento del sodio a través del borde exterior es pasivo, pero altamente selectivo…” fue reforzada aún más por los experimentos de análisis de fluctuaciones realizados por Lindemann y Van Driessche (1977) en los que propusieron que el sodio - canales de membrana específicos bloqueados por amilorida en la piel de rana. Sin embargo, la evidencia experimental de canales epiteliales de Na+ inhibibles por amilorida fue finalmente confirmada por estudios de parche realizados por Hamilton y Eaton (1985, 1986) y Palmer y Frindt (1986). Más de 35 años después de que Koefoed-Johnsen y Ussing publicaran su modelo, los estudios moleculares de Canessa et al. (1993, 1994) identificaron los genes del canal epitelial de Na+, ahora conocido simplemente como ENaC.
Incluso en la era molecular de la fisiología del transporte de iones epiteliales, los científicos todavía regresan a la técnica de corriente de cortocircuito de la cámara de Ussing para demostrar la expresión funcional de las proteínas del canal (absorción de Na+; secreción de Cl− y K+, por ejemplo) y proteínas transportadoras electrogénicas (es decir, cotransportadores de solutos de Na+, cotransportadores de aminoácidos de Na+) e incluso transportadores electroneutros (es decir, absorción de propionato). La simplicidad de la técnica de corriente de cortocircuito de la cámara de Ussing se presta a la investigación de muchos aspectos de la fisiología del transporte de iones epiteliales.
Pensamientos finales
Es difícil imaginar dónde estaría el campo de la fisiología epitelial en el siglo XXI si Ussing no hubiera decidido recrear el “ambiente acuático del estanque” de la rana con sus cámaras llenas de líquido. Hemos pasado de la "caja negra" de una célula epitelial de la década de 1950 a describir muchos mecanismos intrincados de transporte de iones/celulares y vías de señalización que modulan la fisiología del transporte de iones de los epitelios durante los últimos 60 años. Es muy emocionante soñar con los futuros avances en la fisiología del transporte epitelial. Ussing nos dejó su “Cámara pequeña” y con muchas reflexiones sobre la ciencia incluyendo la siguiente “…Esté siempre preparado para rechazar o modificar una hipótesis, si un experimento muestra algo inesperado”.
Expresiones de gratitud
Agradezco al Dr. Steven Condliffe y a dos revisores anónimos por sus comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Junta de Lotería de Nueva Zelanda y el Departamento de Fisiología de la Universidad de Otago.
Referencias
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Canessa, CM, Horisberger, JD y Rossier, BC (1993). Canal de sodio epitelial relacionado con proteínas implicadas en la neurodegeneración. Naturaleza 361, 467–470.
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Clarke, LL (2009). Una guía para los estudios de la cámara de Ussing en el intestino de un ratón. Soy. J. Physiol. Gastrointestinal. Fisiol hepático. 296, G1151–G1166.
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Palmer, LG y Andersen, OS (2008). El modelo de transporte epitelial de dos membranas: Koefoed-Johnsen y Ussing (1958). J. Gen. Physiol. 132, 607–617.
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Ussing, HH y Zerahn, K. (1951). Transporte activo de sodio como fuente de corriente eléctrica en la piel de rana aislada en cortocircuito, Acta Physiol. Escanear. 23, 110-127.
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Cita: Hamilton KL (2011) La “pequeña cámara” de Ussing: más de 60 años y contando. Frente. Fisioterapeuta. 2:6. doi: 10.3389/fphys.2011.00006
El artículo original se puede encontrar en: http://www.frontiersin.org/renal_and_epithelial_physiology/10.3389/fphys.2011.00006/full