用于囊性纤维化治疗的外显子跳跃反义寡核苷酸

囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）基因的突变会导致囊性纤维化（CF），其中CFTR-W1282X无义突变会引起严重的CF表型。
尽管Trikafta等CFTR调节治疗方案可惠及大多数CF患者，但针对W1282X突变患者的特异性治疗目前仍属空白。CFTR-W1282X蛋白虽具有一定残余活性，但由于无义介导的mRNA降解（NMD），其表达水平极低。

目前，针对CFTR无义突变体的NMD抑制疗法和读穿（read-through）疗法正处于积极研究阶段。NMD抑制可增加突变CFTR mRNA的表达，而读穿疗法可能提升全长CFTR蛋白的水平。然而，这些方法存在一定局限性和潜在副作用：因为NMD机制也调控许多正常mRNA的表达，因此广泛抑制该通路并不可取；此外，读穿药物的效率较低，部分原因是突变mRNA模板本身会被NMD降解。

为绕过这些问题，我们采用了一种基于外显子跳跃的反义寡核苷酸（ASO）策略，以实现基因特异性的NMD逃逸。两种剪接位点靶向ASO的组合成功诱导了不含早终止密码子（PTC）外显子23（CFTR-Δex23）的CFTR mRNA表达，外显子23为阅读框内的外显子。

用该ASO组合处理人支气管上皮细胞可有效跳跃外显子23，并增加CFTR-Δex23蛋白的表达。该剪接转换ASO组合显著增强了人支气管上皮细胞中CFTR介导的氯离子电流。

我们的研究为开发针对W1282X突变导致的CF的等位基因特异性疗法奠定了基础。

 

 

Ussing小室实验

将16HBEge细胞培养在Snapwell过滤支架（Corning, 3801）上形成电阻紧密的单层细胞，如文献所述【38】。在实验前，顶端（黏膜侧）和基底（浆膜侧）膜均暴露于反义寡核苷酸（ASOs）处理4天，并分别暴露于CFTR校正剂VX-809、VX-661或VX-445（Selleckchem产品编号：S1565、S7059 和 S8851）24小时。

随后，将Snapwell插入膜转移至Ussing小室中（P2302, Physiologic Instruments, Inc.）。仅浆膜侧灌流5 mL HEPES缓冲生理盐水；黏膜侧使用5 mL CF-HEPES缓冲生理盐水（含137 mM葡糖酸钠、4 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM HEPES 和10 mM葡萄糖，pH调至7.4，使用N-甲基-D-葡萄糖胺）以建立跨上皮氯离子浓度梯度。

将跨上皮电压钳定为0 mV后，使用Physiologic Instruments公司的VCC MC6上皮电压钳系统测量短路电流（ISC），并维持缓冲液温度为37°C。基线电活动记录持续20分钟后，分别以10分钟间隔向浆膜和黏膜两侧依次添加激动剂和抑制剂：

• 激动剂（终浓度）：10 µM forskolin（Sigma, F6886）和10 µM VX-770（Selleckchem, S1144）

• 抑制剂（终浓度）：20 µM CFTRinh-172（Sigma, C2992）

激动剂/抑制剂均来源于200×至1000×的浓缩储备液。数据采集使用ACQUIRE & ANALYZE Revision II软件（Physiologic Instruments）完成。