Guía Completa de la Cámara de Ussing: Protocolos, TEER y Solución de Problemas

Versión corta: Esta guía de la Cámara de Ussing muestra cómo medir PD, Isc y TEER, realizar ensayos de flujo, elegir hardware, preparar soluciones y solucionar problemas rápidamente — ya sea que trabajes con tejido nativo o monocapas.

Última actualización: 12 de agosto de 2025

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Contenido de esta guía

• Qué mide una Cámara de Ussing y por qué

• La física: entender PD, Isc y TEER

• Hardware: Cámaras, electrodos, perfusión, clamps

• Soluciones y recetas (ejemplos prácticos)

• Protocolo: SOP paso a paso

• Análisis de datos, normalización e informes

• Solución de problemas (diagnósticos rápidos)

• Diseño experimental según tipo de tejido

• Lista de verificación de calidad y reproducibilidad

• Seguridad y cumplimiento

• Selección y presupuesto del sistema adecuado

• Apéndices: inicio rápido, cálculos, informes

• Preguntas frecuentes

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1) Qué mide una Cámara de Ussing y por qué

Objetivo. Cuantificar el transporte transepitelial y la integridad de la barrera a través de un tejido o monocapa que separa las soluciones apical y basolateral.

Lecturas eléctricas primarias

• PD (Diferencia de Potencial, mV): voltaje en circuito abierto a través del epitelio.

• Isc (Corriente de Cortocircuito, µA/cm²): transporte iónico neto activo cuando el PD se fija en 0 mV.

• TER / TEER (Ω, Ω·cm²): hermeticidad de la barrera; valores más altos = uniones más estrechas.

TEER está normalizado por área:
TEER = (Rmuestra − Rblanco) × Área

Lecturas de flujo (químicas)

• Flujo paracelular de trazadores (ej. manitol, dextrano-FITC): permeabilidad de uniones estrechas.

• Flujo transcelular (ej. glucosa, aminoácidos): captación mediada por transportadores.

• Permeabilidad aparente (Papp) para un soluto:
  Papp = (dQ/dt) / (A × C0)

Por qué importa. Estas métricas sustentan la investigación en fisiología CFTR/ENaC, EII, enfermedad celíaca, modelos de diarrea, hidratación de vías respiratorias, barrera cutánea y absorción/toxicidad de fármacos.

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2) La física: entendiendo PD, Isc y TEER

• Ley de Ohm (tejido): V = I × R.

• Cuando el voltaje se fija en 0 mV, el Isc inyectado = transporte electrogénico neto (ej. secreción de Cl⁻ mediada por CFTR menos absorción de Na⁺ vía ENaC).

• Resistencias en serie (solución + electrodos + puentes) están fuera del tejido. Un buen diseño coloca electrodos de voltaje cerca del tejido para minimizar caídas.

TEER AC vs DC

• Pulso/step DC: inyectar una pequeña corriente breve; calcular ΔV/ΔI.

• Impedancia AC: un seno pequeño (ej. 1 kHz) permite aislar resistencia y capacitancia epitelial.

Correcciones a aplicar

• Potenciales de unión líquida (LJP): igualar fuerza iónica; usar puentes de agar-KCl.

• Corrección de offset: cortocircuitar electrodos en soluciones simétricas; ajustar PD ≈ 0 mV antes de montar tejido.

• Normalización de área: siempre reportar µA/cm² (Isc) y Ω·cm² (TEER).

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3) Hardware de la Cámara de Ussing: qué hace cada componente

Cámaras y deslizadores (aperturas)

• Clásicas en dos mitades: máxima flexibilidad; requieren más habilidad.

• EasyMount: montaje guiado, rápido, reproducible; reduce daño tisular y variabilidad.

• El diámetro del orificio define sensibilidad y normalización (común: 0.071–0.64 cm²).

• Juntas (grosor, elasticidad) controlan compresión; demasiado apriete → fugas o isquemia.

Electrodos y puentes

• Electrodos Ag/AgCl vía puentes agar–KCl (ej. 3 M KCl en 2–3% agar).

• Colocar electrodos de voltaje cerca del tejido; de corriente más lejos.

• Mantenimiento: re-clorurar alambres Ag; reemplazar puentes nublados o secos.

Perfusión, gas y temperatura

• Burbujeo con 95% O₂ / 5% CO₂ (carbogén) para buffers bicarbonato.

• Perfusión constante/intervalo mantiene concentraciones y evita agotamiento.

• Temperatura: 37 °C con calentadores en bloque o en línea; variaciones de 1–2 °C alteran Isc/TEER.

Clamps y adquisición de datos (DAQ)

• Clamps voltaje-corriente miden PD, inyectan corriente y calculan Isc/TEER automáticamente.

• Software DAQ registra eventos, pasos de protocolo y anotaciones.

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4) Soluciones y recetas de la Cámara de Ussing (ejemplos prácticos)

• Krebs–Ringer Bicarbonato (típico)
  NaCl 117 mM, KCl 4.7 mM, CaCl₂ 2.5 mM, MgSO₄ 1.2 mM, KH₂PO₄ 1.2 mM, NaHCO₃ 25 mM, Glucosa 10 mM.
  Gas: 95% O₂ / 5% CO₂, 37 °C.

• Par osmótico manitol/glucosa
  Serosa: glucosa 10 mM; Apical: manitol 10 mM (o viceversa).

Moduladores comunes

• Amilorida (apical) → bloquea ENaC.

• Forskolina/IBMX → ↑ AMPc → ↑ CFTR.

• Bumetanida (basolateral) → bloquea NKCC1.

• CFTRinh-172 → inhibidor CFTR.

Trazadores para flujos

• Paracelular: manitol, dextrano-FITC.

• Transcelular: glucosa radiomarcada, aminoácidos.

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5) Protocolo Cámara de Ussing: SOP paso a paso

(A) Chequeos previos (10–20 min)

• Offset electrodos ≈ 0 mV en buffer simétrico.

• Estabilizar a 37 °C.

• Pre-gasificar soluciones.

• Rblanco si aplica.

(B) Preparación de tejido/insertos

• Tejido nativo: disección, recorte al diámetro.

• Monocapas: enjuagar, equilibrar 15–30 min.

(C) Montaje (2–5 min con EasyMount)

• Orientar mucosa/apical, serosa/basolateral.

• Comprimir sin arrugas.

(D) Adquisición basal

• Registrar PD, Isc estable.

• Medir TER → TEER.

(E) Intervenciones

• Amilorida (apical) → ↓ Isc.

• Forskolina/IBMX → ↑ Isc.

• Bumetanida → ↓ corriente secretoria.

(F) Muestreo de flujo

• Intervalos cada 10–15 min.

• Calcular Papp.

(G) Cierre & control de calidad

• Verificar offset.

• Documentar temperatura/pH.

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6) Análisis de datos, normalización e informes

• Normalización

  • Isc → µA/cm².

  • TEER = (Rmuestra − Rblanco) × Área.

• Reportes típicos

  • Curvas Isc con adiciones anotadas.

  • Trayectoria TEER pre/post.

  • Flujos vs tiempo.

• Estadística

  • Paired cuando mismo tejido sirve de control.

  • Modelos mixtos para múltiples animales.

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7) Solución de problemas (diagnóstico rápido)

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8) Diseño experimental por tipo de tejido

• Intestino/Colon: considerar indometacina.

• Vía aérea: amilorida (ENaC), forskolina/IBMX (CFTR), bumetanida.

• Piel: TEER alto, sellado robusto.

• Monocapas cultivadas: verificar confluencia, restar resistencia del soporte.

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9) Lista de verificación de calidad y reproducibilidad

• Modelo de cámara, apertura, lote de juntas documentados

• Registros de temperatura/pH

• Offset de electrodos antes/después

• Estabilidad basal (<1%/min)

• Normalización de área aplicada

• Criterios de exclusión predefinidos

• Archivos crudos archivados

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10) Seguridad y cumplimiento

• Radiotrazadores: licencias, blindaje, residuos.

• Tejidos humanos/animales: IRB/IACUC, bioseguridad.

• Riesgos químicos: bumetanida, forskolina, DMSO.

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11) Selección y presupuesto del sistema adecuado

• Docencia/pilotos: canal único, clamp manual.

• Laboratorio central/farma: multicanal, DAQ integrado.

• Screening de barrera: montaje rápido, TEER estable, control de temperatura/perfusión.

Costos: dependen de nº de canales, cámaras y configuración.

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12) Apéndices

(A) SOP rápido

• Precalentar soluciones, 37 °C.

• Zero electrodos.

• Montar tejido.

• Basal PD/Isc/TEER.

• Agregar moduladores.

• Muestrear flujos.

• Cierre: verificar offset.

(B) Cálculos comunes

• Isc densidad = Iraw / Área.

• TEER = (Rmuestra − Rblanco) × Área.

• Papp = (ΔQ/Δt) / (A × C0).

(C) Plantilla de informe

• Tejido, cámara, soluciones, clamp, baseline, fármacos, flujos, estadística.

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13) Preguntas frecuentes

• ¿Qué mide una Cámara de Ussing?

• PD, Isc, TEER — ¿diferencias?

• ¿Cómo calcular TEER correctamente?

• ¿TER vs TEER?

• ¿DC vs AC TEER?

• ¿Tiempo de estabilización?

• ¿Restar resistencia del inserto?

• ¿Qué apertura usar?

• ¿Cómo corregir offset y LJP?

• ¿Condiciones recomendadas de temperatura/gas/pH?

• ¿Buenas prácticas de baseline y reporte?

• ¿Qué moduladores usar?

• ¿Con qué frecuencia muestrear para Papp?

• ¿Por qué señal ruidosa o TEER inestable?